Cette méthode utilise le peptide D DPA, marqué au gallium-68. Le radiotraceur Gallium-68 pour marquer le DPA permet de visualiser en temps réel l’expression de PDL-1 dans l’ensemble du corps de manière non invasive. L’utilisation du peptide D confère au radio-traceur une hyper-résistance à la dégradation protéolytique et prolonge remarquablement leur demi-vie métabolique.
En particulier, la technique peut être appliquée à l’évaluation de différentes maladies, sous réserve de la découverte de cibles spécifiques et du développement de radiotraceurs avec une bonne cinétique d’appel téléphonique. La technique peut également être appliquée au traitement des tumeurs PDL-1 positives tout en marquant le DPA avec d’autres nucléotides radio, tels que le lutécium-177 et l’actinium-225. Wu Jiang, un chercheur de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Pour le radiomarquage de l’antagoniste du peptide d-dodécapeptide, ou DPA, pipeter cinq microlitres du tampon préparé contenant du DPA dans un récipient en polypropylène de 1,5 millilitre avec un bouchon à vis et ajouter 400 microlitres de trichlorure de gallium 68 dans le récipient. Faire tourner le mélange pendant cinq secondes. Mesurez le pH du mélange à l’aide de bandelettes de test de pH et ajustez le pH à 4 à 4,5 avec 0,1 molaire d’hydroxyde de sodium.
Incuber la solution à température ambiante pendant cinq à 10 minutes. Ensuite, en suivant les conditions mentionnées dans le texte, soumettre le mélange réactionnel à la radio-HPLC pour analyser le rendement du radiomarquage. Pour tester la stabilité du traceur dans le PBS, ajoutez 10 microlitres de DPA marqué au gallium-68 dans une solution d’acétate de sodium à 990 microlitres de PBS.
Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant une, deux et quatre heures, en agitant légèrement. Collectez 200 microlitres de la solution à chaque point de temps indiqué et analysez-la par radio HPLC. Pour tester la stabilité du traceur dans le sérum de souris, ajoutez 10 microlitres de DPA marqué au gallium-68 dans une solution d’acétate de sodium à 90 microlitres de sérum de souris fraîchement préparé et incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant une, deux et quatre heures avec une légère agitation.
Ensuite, collectez 20 microlitres de la solution à chaque point de temps indiqué et ajoutez 100 microlitres de mélange d’eau acéto-nitrile dans l’aliquote collectée. Centrifugez le mélange à 5 000 g pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Analyser le surnageant à l’aide d’une HPLC radio.
Cultivez les cellules U-87 MG dans des plaques à 12 puits jusqu’à ce que la confluence soit atteinte à 80 %. Retirez ensuite le milieu et lavez les cellules avec 0,5 millilitre de PBS. Diluer le DPA marqué au gallium-68 dans un milieu frais jusqu’à une concentration de 74 kilobecquerel par millilitre.
Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de tampon DPA dilué marqué au gallium-68 dans chaque puits. Incubez les cellules avec du DPA marqué au gallium-68 à 37 degrés Celsius pendant des durées de 10, 30, 40 et 120 minutes. Après l’incubation, aspirez le milieu à l’aide d’une pipette et lavez les cellules avec 0,5 millilitre de PBS trois fois.
Ensuite, ajoutez 300 microlitres de solution d’hydroxyde de sodium à 0,5 molaire par puits pour lyser les cellules. Après 30 secondes, recueillir les lysats cellulaires visqueux dans des tubes de 1,5 millilitre. Lavez la plaque en ajoutant deux fois 0,4 millilitre de PBS par puits et collectez la solution de lavage dans les tubes de 1,5 millilitre mentionnés.
Démarrez l’ordinateur intégré du compteur gamma automatique et placez les tubes dans l’étagère intégrée. Après avoir chargé tous les échantillons sur le convoyeur, appuyez sur le bouton de démarrage. Les résultats sont calculés dans le logiciel interne, tandis que l’affichage enregistre le nombre de décroissances corrélées par minute, ou CPM, de chaque tube.
Prélever les cellules U-87 MG en suivant le protocole mentionné dans le texte et aspirer les cellules dans une seringue de 0,5 millilitre. Ensuite, prenez des souris nues BALB/c et injectez les cellules par voie sous-cutanée, en maintenant un nombre de deux tumeurs par souris. Surveillez la croissance tumorale après l’injection jusqu’à ce que le volume de la tumeur atteigne 100 à 300 millimètres cubes.
Pour effectuer l’imagerie TEP, injectez les traceurs par voie intraveineuse à l’aide d’un cathéter préinstallé. Créez un flux de travail de numérisation sur un ordinateur hôte à l’aide du logiciel de référence, puis créez un dossier d’étude et définissez le protocole d’acquisition conformément aux instructions du fabricant. Effectuez des scans dynamiques sur chaque souris pendant 60 minutes en mode liste 3D.
Ensuite, définissez un protocole d’histogramme et un protocole de reconstruction, en suivant les instructions du fabricant. Utilisez le filtre de Hanning avec une coupure de Nyquist de 0,5 cycle par pixel pour reconstruire des images dynamiques TEP pendant 25 à 30 minutes, et 55 à 60 minutes grâce à une rétroprojection filtrée. Générez une projection d’intensité maximale, ou des images MIP, pour toutes les souris.
Administrer du DPA marqué au gallium-68 aux souris nues portant du BALB/c porteur de BALB/c par injection dans la veine caudale. Après l’euthanasie, disséquez la paroi thoracique de l’animal et ouvrez le cœur. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, prélevez du sang et pressez le sang de la seringue dans un tube de radio-immunoessai, ou RIA, mesurant 13 millimètres de diamètre pour le compteur gamma.
Exciser les principaux organes et tumeurs et les placer dans des tubes RIA similaires pour le compteur gamma. Pesez tous les principaux organes mentionnés dans le texte. Mesurez la radioactivité dans les organes prélevés à l’aide d’un compteur gamma automatique et corrigez les valeurs par décroissance.
Calculer le pourcentage de dose injectée par gramme de tissu humide. Le DPA marqué au gallium-68 a montré une impureté de rendement radiochimique élevé. Il était très stable à la fois dans le PBS et dans le sérum de souris, ne montrant aucune décomposition du gallium-68 ou hydrolyse peptidique après l’incubation de quatre heures.
Environ 60 % des cellules U-87 MG se sont avérées être programmées pour tuer le ligand un, ou PDL-1 positif par cytométrie en flux, et la coloration immunofluorescente a confirmé une forte expression de PDL-1 dans les cellules U-87 MG. Les cellules U-87 MG ont montré une absorption dépendante du temps de DPA marqué au gallium-68, qui a diminué de manière significative lors de l’utilisation d’un inhibiteur de PDL-1, BMS-202, comme agent bloquant. L’affinité de liaison estimée pour le BMS-202 était de 43,8 nanomoles par litre lorsque le DPA marqué au gallium-68 a été utilisé comme concurrent.
Les images TEP du corps entier ont révélé une forte accumulation de DPA marqué au gallium-68 dans la tumeur après 30 et 60 minutes d’injection. Une expérience parallèle a démontré une faible accumulation de DPA marqué au gallium-68 dans les tumeurs témoins négatives Bon-1 à 60 minutes après l’injection. De plus, la coloration immunohistochimique a révélé que les cellules U-87 MG présentaient une expression considérable de PDL-1, mais pas la tumeur Bon-1.
La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a montré une morphologie cellulaire similaire entre les deux tissus tumoraux. L’étude de biodistribution ex-vivo a montré une clairance rapide de la radioactivité et du sang dans la plupart des organes analysés, y compris le cœur, le foie, les poumons et les muscles. Le rein a accumulé la plus grande quantité de radioactivité, tandis que la tumeur a présenté la deuxième plus grande absorption de traceurs à tous les moments.
La structure du peptide D étant différente, l’utilisation d’une méthode efficace de marquage du DPA avec du gallium-68 est l’étape la plus importante. Cette technique a ouvert la voie à l’exploitation du test TEP en tant que radiopharmaceutique efficace pour gérer différents cancers, à la fois en tant que traceurs TEP et agents de diagnostic radio.
