Este método utiliza el péptido D DPA, marcado con galio-68. El radiotrazador de galio-68 para marcar el DPA permite la visualización en tiempo real de la expresión de PDL-1 en todo el cuerpo de forma no invasiva. El uso del péptido D confiere al radiotrazador hiperresistencia a la degradación proteolítica y prolonga notablemente su vida media metabólica.
En particular, la técnica se puede aplicar para evaluar diferentes enfermedades, sometidas al descubrimiento de dianas específicas y al desarrollo de radiotrazadores con una buena cinética de llamadas telefónicas. La técnica también se puede aplicar al tratamiento de tumores positivos para PDL-1 mientras se marca DPA con otros radionucleótidos, como el lutecio-177 y el actinio-225. La demostración del procedimiento estará a cargo de Wu Jiang, un investigador de mi laboratorio.
Para el radiomarcaje del antagonista del péptido d-dodecapéptido (DPA, por sus siglas en inglés), pipetee cinco microlitros del tampón madre preparado que contiene DPA en un recipiente de polipropileno de 1,5 mililitros con tapón de rosca y agregue 400 microlitros de tricloruro de 68 galios al recipiente. Agita la mezcla durante cinco segundos. Mida el pH de la mezcla con tiras reactivas de pH y ajuste el pH a 4 a 4,5 con hidróxido de sodio 0,1 molar.
Incuba la solución a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. Luego, siguiendo las condiciones mencionadas en el texto, someta la mezcla de reacción a la radio-HPLC para analizar el rendimiento del radiomarcado. Para probar la estabilidad del trazador en PBS, agregue 10 microlitros de DPA marcado con galio-68 en solución de acetato de sodio a 990 microlitros de PBS.
Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante una, dos y cuatro horas, con una ligera agitación. Recoja 200 microlitros de la solución en cada punto de tiempo y analícelo por radio HPLC. Para probar la estabilidad del trazador en suero de ratón, agregue 10 microlitros de DPA marcado con galio-68 en solución de acetato de sodio a 90 microlitros del suero de ratón recién preparado e incube la mezcla a 37 grados centígrados durante una, dos y cuatro horas con una ligera agitación.
A continuación, recoja 20 microlitros de la solución en cada punto de tiempo y añada 100 microlitros de la mezcla de aceto nitrilo y agua a la alícuota recogida. Centrifugar la mezcla a 5.000 g durante 10 minutos a 25 grados centígrados. Analice el sobrenadante mediante radioHPLC.
Cultivar las células U-87 MG en placas de 12 pocillos hasta alcanzar una confluencia del 80%. A continuación, retire el medio y lave las células con 0,5 mililitros de PBS. Diluya el DPA marcado con galio-68 en medio fresco hasta una concentración de 74 kilobecquerel por mililitro.
A continuación, añada 0,5 mililitros del tampón DPA diluido marcado con galio-68 a cada pocillo. Incubar las células con DPA marcado con galio-68 a 37 grados centígrados durante 10, 30, 40 y 120 minutos. Después de la incubación, aspire el medio con una pipeta y lave las células con 0,5 mililitros de PBS tres veces.
A continuación, agregue 300 microlitros de solución de hidróxido de sodio 0.5 molar por pocillo para lisar las células. Después de 30 segundos, recoja los lisados de células viscosas en tubos de 1,5 mililitros. Lave la placa agregando 0,4 mililitros de PBS por pocillo dos veces y recoja la solución de lavado en los tubos de 1,5 mililitros mencionados.
Encienda la computadora incorporada del contador gamma automático y coloque los tubos en el estante incorporado. Después de cargar todas las muestras en la cinta transportadora, presione el botón de inicio. Los resultados se calculan en el software interno, mientras que la lectura registra los recuentos correlacionados de decaimiento por minuto, o CPM, de cada tubo.
Recoger las células U-87 MG siguiendo el protocolo mencionado en el texto y aspirar las células en una jeringa de 0,5 mililitros. A continuación, tome ratones BALB/c Nude e inyecte las células por vía subcutánea, manteniendo un recuento de dos tumores por ratón. Vigile el crecimiento del tumor después de la inyección hasta que el volumen del tumor sea de 100 a 300 milímetros cúbicos.
Para realizar la toma de imágenes por TEP, inyecte los marcadores por vía intravenosa a través de un catéter de vena de cola preinstalado. Cree un flujo de trabajo de escaneo en una computadora host con el software de referencia, seguido de la creación de una carpeta de estudio y la configuración del protocolo de adquisición según las pautas del fabricante. Realice escaneos dinámicos en cada mouse durante 60 minutos en modo de lista 3D.
A continuación, defina un protocolo de histograma y un protocolo de reconstrucción, siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice el filtro de Hanning con un corte de Nyquist de 0,5 ciclos por píxel para reconstruir imágenes dinámicas PET durante 25 a 30 minutos, y de 55 a 60 minutos a través de la retroproyección filtrada. Genere imágenes de proyección de máxima intensidad, o MIP, para todos los ratones.
Administrar DPA marcado con galio-68 a los ratones desnudos con BALB/c portadores de BALB/c U-87 a través de la inyección en la vena de la cola. Después de la eutanasia, diseccionar la pared torácica del animal y abrir el corazón. Con una jeringa de un mililitro, extraiga sangre y exprima la sangre de la jeringa en un tubo de radioinmunoensayo, o RIA, que mide 13 milímetros de diámetro para el contador gamma.
Extirpar los órganos y tumores principales y colocarlos en tubos similares de RIA para el contador gamma. Pondera todos los órganos principales mencionados en el texto. Mida la radiactividad dentro de los órganos recolectados usando un contador gamma automático y corrija los valores de descomposición.
Calcule el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido húmedo. El DPA marcado con galio-68 mostró una impureza de alto rendimiento radioquímico. Fue altamente estable tanto en PBS como en suero de ratón, sin mostrar descomposición de galio-68 ni hidrólisis peptídica después de la incubación de cuatro horas.
Se encontró que aproximadamente el 60% de las células U-87 MG estaban programadas para morir el ligando uno, o PDL-1 positivo por citometría de flujo, y la tinción inmunofluorescente confirmó una fuerte expresión de PDL-1 en las células U-87 MG. Las células U-87 MG mostraron una captación dependiente del tiempo de DPA marcada con galio-68, que se redujo significativamente con el uso de un inhibidor de PDL-1, BMS-202, como agente bloqueante. La afinidad de unión estimada para BMS-202 fue de 43,8 nanomoles por litro cuando se utilizó DPA marcado con galio-68 como competidor.
Las imágenes PET de cuerpo entero revelaron una alta acumulación de DPA marcada con galio-68 en el tumor después de 30 y 60 minutos de la inyección. En un experimento paralelo, se demostró poca acumulación de DPA marcada con galio-68 en los tumores Bon-1 de control negativo a los 60 minutos después de la inyección. Además, la tinción inmunohistoquímica reveló que las células U-87 MG presentaban una expresión considerable de PDL-1, pero no el tumor Bon-1.
La tinción con hematoxilina y eosina mostró una morfología celular similar entre los dos tejidos tumorales. El estudio de biodistribución ex vivo mostró una rápida eliminación de la radiactividad y la sangre en la mayoría de los órganos analizados, incluidos el corazón, el hígado, los pulmones y los músculos. El riñón acumuló la mayor cantidad de radiactividad, mientras que el tumor exhibió la segunda mayor captación de trazadores en todos los puntos temporales.
El hecho de que la estructura del péptido D sea diferente utilizando un método eficiente para marcar DPA con galio-68 es el paso más importante. Esta técnica allanó el camino para explotar la prueba PET como radiofármacos eficaces para tratar diferentes tipos de cáncer, tanto como trazadores PET como agentes radiodiagnósticos.
