שיטה זו משתמשת ב- DPA D-פפטידי, המסומן ב- Gallium-68. נותב הרדיו גליום-68 לסימון DPA מאפשר הדמיה בזמן אמת של ביטוי PDL-1 בכל הגוף באופן לא פולשני. השימוש ב-D-peptide מעניק לנותב הרדיו עמידות יתר בפני פירוק פרוטאוליטי ומאריך באופן מרשים את מחצית החיים המטבולית שלהם.
בפרט, הטכניקה יכולה להיות מיושמת כדי להעריך מחלות שונות, נתון לגילוי של מטרות ספציפיות ופיתוח של נותבי רדיו עם קינטיקה טובה שיחת טלפון. ניתן ליישם את הטכניקה גם לטיפול בגידולים חיוביים PDL-1 תוך תיוג DPA עם נוקלאוטידים רדיופוניים אחרים, כגון לוטטיום-177 ואקטיניום-225. מי שידגים את ההליך יהיה וו ג'יאנג, חוקר מהמעבדה שלי.
עבור radiolabeling פפטיד d-dodecapeptide אנטגוניסט, או DPA, פיפטה חמישה מיקרוליטר של מאגר מלאי מוכן המכיל DPA לתוך מיכל פוליפרופילן 1.5 מיליליטר עם מכסה בורג ולהוסיף 400 מיקרוליטר של 68 גליום trichloride למיכל. מערבבים את התערובת במשך חמש שניות. מדוד את ה- pH של התערובת באמצעות רצועות בדיקת pH והתאם את ה- pH ל- 4 עד 4.5 עם נתרן הידרוקסידי מולרי 0.1.
לדגור על התמיסה בטמפרטורת החדר במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, בהתאם לתנאים המוזכרים בטקסט, הכפיפו את תערובת התגובה לרדיו HPLC לצורך ניתוח תפוקת תיוג הרדיו. כדי לבדוק את יציבות הנותב ב-PBS, הוסף 10 מיקרוליטר של DPA עם תווית גליום-68 בתמיסת נתרן אצטט ל-990 מיקרוליטר של PBS.
דוגרים על התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, שעתיים וארבע שעות, עם תסיסה קלה. לאסוף 200 מיקרוליטר של הפתרון בכל נקודת זמן אמר ולנתח אותו על ידי רדיו HPLC. כדי לבדוק את יציבות הנותב בסרום עכברים, הוסף 10 מיקרוליטר של DPA עם תווית Gallium-68 בתמיסת נתרן אצטט ל- 90 מיקרוליטר של סרום העכבר הטרי והוכן ודגור על התערובת ב- 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, שעתיים וארבע שעות עם תסיסה קלה.
לאחר מכן לאסוף 20 מיקרוליטר של הפתרון בכל נקודת זמן אמר ולהוסיף 100 מיקרוליטר של תערובת מים ניטריל aceto לתוך aliquot נאסף. צנטריפוגה את התערובת ב 5, 000 גרם במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. נתח את supernatant באמצעות רדיו HPLC.
תרבית את תאי U-87 MG בצלחות של 12 בארות עד שתגיע למפגש של 80%. לאחר מכן להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של PBS. יש לדלל את התר"מ המסומן בגליום-68 בתווך טרי לריכוז של 74 קילובקרל למיליליטר.
לאחר מכן הוסיפו 0.5 מיליליטר של חיץ DPA מדולל מסוג גליום-68 לכל באר. דגרו על התאים עם DPA המסומן ב-Gallium-68 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10, 30, 40 ו-120 דקות. לאחר הדגירה, שואפים את המדיום באמצעות פיפטה ולשטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של PBS שלוש פעמים.
לאחר מכן, להוסיף 300 מיקרוליטר של 0.5 מולרית נתרן הידרוקסיד פתרון לכל באר כדי lyse את התאים. לאחר 30 שניות, לאסוף את התא צמיג lysates בצינורות 1.5 מיליליטר. לשטוף את הצלחת על ידי הוספת 0.4 מיליליטר של PBS לכל באר פעמיים, ולאסוף את פתרון הכביסה בצינורות 1.5 מיליליטר שהוזכרו.
הפעל את המחשב המובנה של מונה הגמא האוטומטי והכניס את הצינורות למדף המובנה. לאחר טעינת כל הדגימות על המסוע, לחץ על כפתור ההפעלה. התוצאות מחושבות בתוכנה הפנימית, בעוד שהקריאה מתעדת את הספירה המתואמת לדעיכה לדקה, או CPM, של כל צינור.
לאסוף את תאי U-87 MG בהתאם לפרוטוקול המוזכר בטקסט ולשאוף את התאים לתוך מזרק 0.5 מיליליטר. לאחר מכן, קח עכברים עירומים BALB/c והזריק את התאים תת עורית, תוך שמירה על ספירה של שני גידולים לכל עכבר. עקוב אחר צמיחת הגידול לאחר ההזרקה עד שנפח הגידול הוא 100 עד 300 מילימטרים מעוקבים.
כדי לבצע הדמיית PET, יש להזריק את העוקבים לווריד דרך צנתר וריד זנב מותקן מראש. צור זרימת עבודה של סריקה במחשב מארח באמצעות תוכנת ההפניה, ולאחר מכן צור תיקיית לימוד והגדר את פרוטוקול הרכישה בהתאם להנחיות היצרן. בצע סריקות דינמיות בכל עכבר במשך 60 דקות במצב רשימה תלת-ממדית.
לאחר מכן, הגדר פרוטוקול היסטוגרמה ופרוטוקול שחזור, בהתאם להוראת היצרן. השתמשו בפילטר של Hanning עם חיתוך Nyquist של 0.5 מחזורים לפיקסל כדי לבנות מחדש תמונות דינמיות של PET במשך 25 עד 30 דקות, ו-55 עד 60 דקות באמצעות הקרנה אחורית מסוננת. צרו הקרנה בעוצמה מרבית, או תמונות MIP, לכל העכברים.
יש לתת DPA עם תווית Gallium-68 לעכברים עירומים U-87 MG הנושא BALB/c באמצעות הזרקת ורידי זנב. לאחר המתת חסד, לנתח את קיר החזה של החיה ולפתוח את הלב. באמצעות מזרק של מיליליטר, לשאוב דם ולסחוט את הדם מן המזרק לתוך צינור אימונואסאי רדיו, או RIA, בקוטר 13 מ"מ עבור מונה גמא.
הבלו את האיברים העיקריים ואת הגידולים ומניחים אותם צינורות RIA דומים עבור מונה גמא. לשקול את כל האיברים העיקריים המוזכרים בטקסט. למדוד את הרדיואקטיביות בתוך האיברים שנאספו באמצעות מונה גמא אוטומטי ודעיכה לתקן את הערכים.
חישוב אחוז המינון המוזרק לגרם של רקמה רטובה. ה-DPA שכותרתו גליום-68 הראה זיהום גבוה בתפוקת רדיו-כימיקלים. הוא היה יציב מאוד הן ב-PBS והן בסרום עכברים, ולא הראה פירוק של גליום-68 או הידרוליזה פפטידית לאחר הדגירה של ארבע שעות.
כ-60% מתאי U-87 MG תוכנתו למוות ליגנד אחד, או PDL-1 חיובי על ידי ציטומטריית זרימה, וצביעה אימונופלואורסצנטית אישרה ביטוי חזק של PDL-1 בתאי U-87 MG. תאי U-87 MG הראו ספיגה תלוית זמן של DPA עם תווית גליום-68, אשר פחתה באופן משמעותי עם שימוש במעכב PDL-1, BMS-202, כחומר חוסם. הזיקה המשוערת ל-BMS-202 הייתה 43.8 ננומול לליטר כאשר DPA המסומן על ידי גליום-68 שימש כמתחרה.
תמונות PET לכל הגוף חשפו הצטברות DPA גבוהה עם תווית גליום-68 בגידול לאחר 30 ו-60 דקות של הזרקה. ניסוי מקביל הדגים הצטברות DPA מועטה בקבוצת הביקורת השלילית Bon-1 ב-60 דקות לאחר ההזרקה. יתר על כן, צביעה אימונוהיסטוכימית גילתה כי תאי U-87 MG הציגו ביטוי PDL-1 משמעותי, אך לא את הגידול Bon-1.
צביעת המטוקסילין ואוזין הראתה מורפולוגיית תאים דומה בין שתי רקמות הגידול. מחקר ההפצה הביולוגית ex-vivo הראה פינוי מהיר של רדיואקטיביות ודם ברוב האיברים שנותחו, כולל הלב, הכבד, הריאות והשרירים. הכליה צברה את הכמות הגבוהה ביותר של רדיואקטיביות, בעוד הגידול הציג את ספיגת הנותב השנייה בגובהה בכל נקודות הזמן.
המבנה של D-פפטיד שונה באמצעות שיטה יעילה לסימון DPA עם גליום-68 הוא השלב החשוב ביותר. טכניקה זו סללה את הדרך לניצול בדיקת PET כתרופות רדיו יעילות לניהול סוגי סרטן שונים, הן כעוקבי PET והן כסוכני אבחון רדיו.
