基于蛋黄抗体的细胞术微球测定的标准化

在旨在诊断疾病的免疫测定技术中，细胞术微球测定已成为一种高度灵敏和可靠的方法，可在单次测定中分析数千个颗粒。流式细胞术的高精度，加上乳胶珠的低成本，使我们的技术适用于免疫分析工具，如抗体和抗原。IgY抗体具有成本低廉，且在其生产中具有伦理优势，可作为罕见病的检测工具。

首先将来自瘿白谱系的新鲜产卵或四天大的鸡蛋浸入0.2%稀释的次氯酸钠溶液中。在流水下快速冲洗，然后轻轻擦拭。小心地打碎鸡蛋，在蛋黄分离器的帮助下将蛋黄与蛋白分开。

并用滤纸去除多余的白色。刺穿蛋黄，并将其内部收集到50毫升的锥形管中。使用前将蛋黄存放在零下 20 摄氏度至少 24 小时。

解冻储存的蛋黄后，在一毫摩尔PBS中以1:10的比例稀释。用一种普通盐酸将溶液的pH值调节到5，并将溶液在4摄氏度下孵育6至24小时。将溶液以3000g离心40分钟，并使用0.7毫米纤维素过滤器过滤回收的上清液，然后将上清液的pH值重新调节至5。

在不断搅拌下加入辛酸至终浓度为8.7%，在4摄氏度下加热30分钟。将样品离心15分钟后，将上清液与沉淀材料分离。使用一摩尔氢氧化钠将溶液的pH值重新调节至7.4。

并使用布拉德福德测定法定量抗体，然后将其储存在零下20摄氏度。将 21 微升 EDC 和 21 微升 NHS 添加到 21 微升乳胶珠中。并调整至2.1毫升的最终体积，过滤10毫摩尔PBS。

将溶液在22摄氏度下快速振荡孵育三小时。将先前提取的捕获抗体IgY PfHRP2添加到含有100微升该溶液的不同微管中。并再次孵育16小时。

离心样品并丢弃上清液后，使用离心和重悬循环，用500微升过滤的10毫摩尔PBS洗涤乳胶珠两次。为了封闭磁珠，将样品重悬于一毫升封闭缓冲液中，并按照前面所示的相同步骤将其孵育两个小时。用PBS洗涤珠子后，再次将其重悬于10毫摩尔PBS缓冲液中。

向每个微管中加入100微升荧光抗鸡抗体，在PBS和BSA的10毫摩尔混合物中稀释至2000。将样品在黑暗中孵育30分钟。清洗珠子后，用250微升过滤的10毫摩尔PBS再次重悬。

通过将 100 μL 封闭的磁珠制剂分配到含有不同量稀释重组蛋白 PfHRP2 的试管中一式三份来确定检测限。将珠子溶液与蛋白质一起在22摄氏度下快速振荡孵育一小时。如前所述，用500微升过滤的10毫摩尔PBS离心洗涤珠子。

弃去上清液后，加入两微克针对重组蛋白的小鼠IgG抗体，用10毫摩尔PBS和BSA稀释到每个样品中，并按照相同的程序进行孵育。接下来，向每个样品中加入100微升稀释的荧光抗小鼠抗体。孵育后，将样品重悬于250微升过滤的10毫摩尔PBS中。

打开计算机和流式细胞仪，等待几分钟，让设备连接到计算机。单击计算机上安装的细胞术软件并登录。从软件工作区中，选择流式细胞仪，然后选择流体启动、清洁模式和 SIT 冲洗。

根据阴性对照颗粒的形态和荧光特性定义设门策略。要确定细胞形态测量，请选择点图图形以使用侧向散射 A 分析前向散射 A 参数。使用点图图形确定单个像元，以分析 Y 轴上的侧向散射 W 和 X 轴上的侧向散射 H。并通过前向散射确定单个细胞，使用点阵图图形，用于分析Y轴上的前向散射W和X轴的前向散射H。

对于荧光分析，使用前向散射选择FL1点阵图 A.使用含有未标记样品的带塞聚苯乙烯管，以及先前用单色Alexa Fluor 488标记的样品，并小心地混合管的内容物。将试管连接到流式细胞仪探头上，然后单击左键获取。要设置激光器的功率，请单击参数，然后在下面的选项中，将前向散射的电压调整为 182 伏，将侧向散射的电压调整为 236 伏。

要在细胞仪上设置阈值，请单击阈值，然后在下面的选项中将FSC调整为500伏。设置分析门以按大小和复杂性表征颗粒，以及执行单细胞分析。通过分析仅含有乳胶珠的无染料样品并将检测器FL1 FITC的电压调节至332伏来去除自发荧光。

将荧光分析门设置为四边形格式，从点图中显示的负点开始。调整形态学和荧光分析后，为设备配置50， 000个事件，然后单击"记录"。此处显示了由于使用辛酸分离而引起的IgY PfHRP2抗体的电泳图谱。

从该图可以看出，辛酸分离前后的抗体表现出相似的电泳谱，特征带为65千道尔顿和27千道尔顿，指的是IgY的轻链和重链。除此之外，其他条带也可见，可能是由于蛋黄蛋白卵黄素II前体的C末端片段。评估乳胶珠上的抗体饱和浓度对于开发珠子的免疫测定至关重要。

此处显示了不同浓度抗体与所使用的每微升商业乳胶珠耦合的荧光百分比曲线。随着浓度的增加，百分比值也随之增加，并稳定在2μg抗体浓度，使其成为靶抗原免疫测定的最佳偶联浓度。通过评估乳胶速度反应性对不同rPfHRP2蛋白浓度的荧光百分比来确定检测限。

从夹心免疫测定中观察到荧光从0.01微克PfHRP2蛋白增加，并稳定在0.1微克。0微克和0.01微克时的荧光无显著差异。然而，在0.01微克，0.1微克和10微克时观察到荧光的显着差异。

该方案的洗涤步骤对于避免珠子的损失至关重要。仪表必须明确定义，以便获得的结果没有错误。这里描述的步骤代表了重要的标准化，这对于确保使用通过全细胞术评估的乳胶珠进行诊断测试的可靠性是必要的。

因此，这种方法是经典夹心测试模型的替代方案。该方法可应用于不同类型的测定，并且可能适用于将多个分子复制到磁珠表面，以及检测不同的分析物。