Unter den Immunoassay-Techniken, die auf die Diagnose von Krankheiten abzielen, hat sich der zytometrische Bead-Assay als hochempfindlicher und zuverlässiger Ansatz erwiesen, der Tausende von Partikeln in einem einzigen Assay analysiert. Die hohe Genauigkeit der Durchflusszytometrie, gepaart mit den niedrigen Kosten von Latexkügelchen, machen unsere Technik für die Analyse von Immunoassays-Werkzeugen wie Antikörpern und Antigenen anwendbar. IgY-Antikörper haben niedrige Kosten und ethische Vorteile bei ihrer Herstellung und können als Nachweisinstrument für seltene Krankheiten verwendet werden.
Beginnen Sie damit, die frisch gelegten oder vier Tage alten Eier der Linie Gallus gallus Deckle White in eine 0,2%ige verdünnte Lösung von Natriumhypochlorit zu tauchen. Spülen Sie sie schnell unter fließendem Wasser ab und wischen Sie sie vorsichtig ab. Das Ei vorsichtig aufschlagen, das Eigelb mit Hilfe eines Eigelbabscheiders vom Eiweiß trennen.
Und entfernen Sie das überschüssige Weiß mit Filterpapier. Stechen Sie das Eigelb ein und sammeln Sie sein Inneres in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Lagern Sie das Eigelb vor der Anwendung mindestens 24 Stunden bei minus 20 Grad Celsius.
Nachdem Sie das gelagerte Eigelb aufgetaut haben, verdünnen Sie es im Verhältnis eins zu 10 in einem millimolaren PBS. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einer normalen Salzsäure auf fünf ein und inkubieren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius für sechs bis 24 Stunden. Die Lösung wird 40 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert und der zurückgewonnene Überstand mit einem 0,7-Millimeter-Zellulosefilter filtriert, bevor der pH-Wert des Überstands auf fünf eingestellt wird.
Caprylsäure wird unter ständigem Rühren 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bis zu einer Endkonzentration von 8,7 % zugegeben. Nachdem Sie die Proben 15 Minuten lang zentrifugiert haben, trennen Sie den Überstand vom gefällten Material. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem molaren Natriumhydroxid auf 7,4 um.
Und quantifizieren Sie die Antikörper mit dem Bradford-Assay, bevor Sie sie bei minus 20 Grad Celsius lagern. Füge 21 Mikroliter EDC und 21 Mikroliter NHS zu 21 Mikrolitern Latexkügelchen hinzu. Und stellen Sie sich auf ein Endvolumen von 2,1 Millilitern ein, mit gefiltertem 10 Millimolar PBS.
Die Lösung wird bei 22 Grad Celsius unter schnellem Schütteln drei Stunden lang inkubiert. Geben Sie den zuvor extrahierten Fängerantikörper IgY PfHRP2 in verschiedene Mikroröhrchen, die 100 Mikroliter dieser Lösung enthalten. Und erneut 16 Stunden inkubieren.
Nach dem Zentrifugieren der Proben und dem Verwerfen der Überstände werden die Latexkügelchen zweimal mit 500 Mikrolitern gefiltertem 10 Millimolar PBS gewaschen, wobei Zentrifugations- und Resuspensionszyklen verwendet werden. Für die Blockierung der Kügelchen werden die Proben in einem Milliliter Blockierungspuffer resuspendiert und befolgen Sie das gleiche zuvor gezeigte Verfahren, um sie zwei Stunden lang zu inkubieren. Nachdem Sie die Kügelchen mit PBS gewaschen haben, resuspendieren Sie sie erneut in 10 Millimolar PBS-Puffer.
In jedes Mikroröhrchen werden 100 Mikroliter fluoreszierender Anti-Hühner-Antikörper, verdünnt auf eins zu 2000 in einer 10-millimolaren Mischung aus PBS und BSA, gegeben. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln. Nachdem Sie die Perlen gewaschen haben, resuspendieren Sie sie erneut mit 250 Mikrolitern gefiltertem 10 Millimolar PBS.
Die Nachweisgrenze wird bestimmt, indem 100 Mikroliter des blockierten Kügelchenpräparats in Röhrchen verteilt werden, die unterschiedliche Mengen des verdünnten rekombinanten Proteins PfHRP2 in dreifacher Ausführung enthalten. Die Kügelchenlösungen mit dem Protein bei 22 Grad Celsius unter schnellem Schütteln eine Stunde lang inkubieren. Waschen Sie die Kügelchen mit 500 Mikrolitern gefiltertem 10 Millimolar PBS unter Zentrifugation, wie zuvor gezeigt.
Nach dem Verwerfen des Überstandes werden zwei Mikrogramm Maus-IgG-Antikörper gegen das rekombinante Protein, verdünnt in 10 Millimolar PBS und BSA, in jede Probe gegeben und das gleiche Verfahren für die Inkubation befolgt. Als nächstes werden 100 Mikroliter des verdünnten fluoreszierenden Anti-Maus-Antikörpers zu jeder Probe gegeben. Nach der Inkubation wird die Probe in 250 Mikroliter filtriertem 10 Millimolar PBS resuspendiert.
Schalten Sie den Computer und das Durchflusszytometer ein und warten Sie einige Minuten, bis das Gerät eine Verbindung zum Computer hergestellt hat. Klicken Sie auf die auf dem Computer installierte Zytometrie-Software und melden Sie sich an. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software Zytometer, gefolgt von Fluidik-Start, Reinigungsmodi und SIT-Spülung aus.
Definieren Sie die Gating-Strategie basierend auf den morphometrischen und Fluoreszenzeigenschaften des Negativkontrollpartikels. Um die Zellmorphometrie zu bestimmen, wählen Sie für die Analyse der Parameter der Vorwärtsstreuung A die Punktplotgrafik mit der Seitenstreuung A.Bestimmen Sie die einzelnen Zellen durch die Seitenstreuung mit der Punktplotgrafik für die Analyse der Seitenstreuung W in der Y-Achse und der Seitenstreuung H in der X-Achse. Und bestimmen Sie die einzelnen Zellen durch Vorwärtsstreuung, indem Sie die Punktdiagrammgrafik für die Analyse der Vorwärtsstreuung W auf der Y-Achse und der Vorwärtsstreuung H auf der X-Achse verwenden.
Wählen Sie für die Fluoreszenzanalyse FL1-Punktdiagramme mit Vorwärtsstreuung A. Verwenden Sie ein Styroporröhrchen mit Stopfen und Proben, die zuvor mit einfarbigem Alexa Fluor 488 markiert wurden, und mischen Sie den Inhalt des Röhrchens vorsichtig. Befestigen Sie das Röhrchen an der Durchflusszytometersonde und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Erfassen. Um die Leistung der Laser einzustellen, klicken Sie auf Parameter und stellen Sie in den folgenden Optionen die Spannung der Durchlassstreuung auf 182 Volt und die Spannung der Seitenstreuung auf 236 Volt ein.
Um den Schwellenwert am Zytometer einzustellen, klicken Sie auf Schwellenwert und stellen Sie in den folgenden Optionen die FSC auf 500 Volt ein. Stellen Sie das Analysegatter ein, um Partikel nach Größe und Komplexität zu charakterisieren und Einzelzellanalysen durchzuführen. Entfernen Sie die Autofluoreszenz, indem Sie die farbstofffreie Probe, die nur die Latexkügelchen enthält, analysieren und die Spannung des Detektors FL1 FITC auf 332 Volt einstellen.
Stellen Sie das Fluoreszenzanalyse-Gate im viereckigen Format ein, ausgehend von dem negativen Punkt, der im Punktdiagramm angezeigt wird. Nachdem die morphometrischen und fluoreszierenden Analysen angepasst wurden, konfigurieren Sie das Gerät für 50.000 Ereignisse und klicken Sie auf Aufzeichnen. Die elektrophoretischen Profile des IgY-PfHRP2-Antikörpers, bedingt durch die Trennung mit Caprylsäure, sind hier dargestellt.
Aus dieser Abbildung ist ersichtlich, dass die Antikörper vor und nach der Caprylsäuretrennung ähnliche elektrophoretische Profile aufwiesen, mit charakteristischen Banden von 65 Kilodalton und 27 Kilodalton, die sich auf die leichten und schweren Ketten des IgY beziehen. Darüber hinaus sind auch andere Banden sichtbar, wahrscheinlich aufgrund des C-terminalen Eigelbprotein-Vitellogenin-II-Vorläufers. Die Beurteilung der Antikörpersättigungskonzentration auf Latexkügelchen ist für die Entwicklung eines Immunoassays mit den Kügelchen von entscheidender Bedeutung.
Eine Kurve der prozentualen Fluoreszenz verschiedener Konzentrationen von Antikörpern, gekoppelt an jeden Mikroliter kommerzieller Latexkügelchen, ist hier dargestellt. Mit steigender Konzentration stiegen auch die Prozentwerte an und erreichten ein Plateau bei zwei Mikrogramm Antikörperkonzentration, was sie als optimale Kopplungskonzentration für den Zielantigen-Immunoassay etablierte. Die Nachweisgrenze wurde bestimmt, indem der Fluoreszenzprozentsatz der Latexgeschwindigkeitsreaktivität gegen unterschiedliche rPfHRP2-Proteinkonzentrationen bestimmt wurde.
Bei einem Sandwich-Immunoassay wurde beobachtet, dass die Fluoreszenz ab 0,01 Mikrogramm PfHRP2-Protein erhöht war und bei 0,1 Mikrogramm ein Plateau erreichte. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Fluoreszenz bei null Mikrogramm und 0,01 Mikrogramm. Ein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenz wurde jedoch bei 0,01 Mikrogramm, 0,1 Mikrogramm und 10 Mikrogramm beobachtet.
Der Waschschritt dieses Protokolls ist entscheidend, um den Verlust von Perlen zu vermeiden. Das Messgerät muss gut definiert sein, damit das erzielte Ergebnis keine Fehler aufweist. Die hier beschriebenen Schritte stellen eine wichtige Standardisierung dar, die notwendig ist, um die Zuverlässigkeit der diagnostischen Tests mit Latexkügelchen zu gewährleisten, die mittels Vollzytometrie ausgewertet werden.
Daher ist diese Methodik eine Alternative zu den klassischen Sandwich-Testmodellen. Diese Methode kann auf verschiedene Arten von Assays angewendet werden und eignet sich sowohl für die Übertragung mehrerer Moleküle auf die Oberfläche der Kügelchen als auch für die Detektion verschiedener Analyten.
