Entre las técnicas de inmunoensayo destinadas al diagnóstico de enfermedades, el ensayo de perlas citométricas se ha convertido en un enfoque altamente sensible y fiable, que analiza miles de partículas en un solo ensayo. La alta precisión de la citometría de flujo, junto con el bajo costo de las perlas de látex, hacen que nuestra técnica sea aplicable para el análisis de herramientas de inmunoensayos, como anticuerpos y antígenos. Los anticuerpos IgY tienen un bajo costo, y las ventajas éticas en su producción, y pueden ser utilizados como una herramienta de detección de enfermedades raras.
Comience sumergiendo los huevos recién puestos o de cuatro días de edad, del linaje blanco Gallus gallus deckle, en una solución diluida al 0,2% de hipoclorito de sodio. Enjuáguelos rápidamente con agua corriente y límpielos suavemente. Rompe el huevo con cuidado, separa la yema de la clara con ayuda de un separador de yemas.
Y retira el exceso de blanco con papel de filtro. Perfora la yema y recoge su interior en un tubo cónico de 50 mililitros. Guarde la yema a menos 20 grados centígrados durante al menos 24 horas antes de usarla.
Después de descongelar la yema almacenada, dilúyala en una proporción de uno a 10 en un milimolar PBS. Ajuste el pH de la solución a cinco, con un ácido clorhídrico normal, e incube la solución a cuatro grados centígrados durante seis a 24 horas. Centrifugar la solución a 3000 G durante 40 minutos y filtrar el sobrenadante recuperado con un filtro de celulosa de 0,7 milímetros, antes de reajustar el pH del sobrenadante a cinco.
Añadir ácido caprílico hasta una concentración final del 8,7% bajo agitación constante, durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de centrifugar las muestras durante 15 minutos, separe el sobrenadante del material precipitado. Vuelva a ajustar el pH de la solución a 7,4 utilizando un hidróxido de sodio molar.
Y cuantificar los anticuerpos mediante el ensayo de Bradford, antes de almacenarlos a menos 20 grados centígrados. Agregue 21 microlitros de EDC y 21 microlitros de NHS a 21 microlitros de perlas de látex. Y ajustar a un volumen final de 2,1 mililitros, con PBS filtrado de 10 milimolares.
Incubar la solución a 22 grados centígrados, con agitación rápida, durante tres horas. Añadir el anticuerpo de captura previamente extraído, IgY PfHRP2, a diferentes microtubos que contengan 100 microlitros de esta solución. E incubar de nuevo durante 16 horas.
Después de centrifugar las muestras y desechar los sobrenadantes, lavar las perlas de látex dos veces con 500 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares, utilizando ciclos de centrifugación y resuspensión. Para el bloqueo de las perlas, resuspender las muestras en un mililitro de tampón de bloqueo, y seguir el mismo procedimiento mostrado anteriormente para incubarlo durante dos horas. Después de lavar las perlas con PBS, vuelva a suspenderlas en tampón PBS de 10 milimolares.
Agregue 100 microlitros de anticuerpo fluorescente anti-pollo, diluido a uno a 2000 en una mezcla de 10 milimolares de PBS y BSA, a cada microtubo. Incubar las muestras en la oscuridad durante 30 minutos. Después de lavar las perlas, vuelva a suspenderlas con 250 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares.
Determine el límite de detección distribuyendo 100 microlitros de la preparación de perlas bloqueadas en tubos que contengan diferentes cantidades de la proteína recombinante diluida PfHRP2 por triplicado. Incubar las soluciones de perlas con la proteína a 22 grados centígrados, con agitación rápida, durante una hora. Lavar las perlas con 500 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares, con centrifugación, como se demostró anteriormente.
Después de descartar el sobrenadante, agregue dos microgramos de anticuerpo IgG de ratón contra la proteína recombinante, diluido en 10 milimolares PBS y BSA a cada muestra, y siga el mismo procedimiento para la incubación. A continuación, agregue 100 microlitros del anticuerpo fluorescente diluido contra el ratón a cada muestra. Después de la incubación, vuelva a suspender la muestra en 250 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares.
Encienda la computadora y el citómetro de flujo, y espere unos minutos para que el equipo se conecte a la computadora. Haga clic en el software de citometría instalado en la computadora e inicie sesión en él. En el espacio de trabajo del software, seleccione Citómetro, seguido de Inicio de fluidos, Modos de limpieza y Lavado SIT.
Defina la estrategia de compuerta en función de las características morfométricas y de fluorescencia de la partícula de control negativo. Para determinar la morfometría de la celda, elija el gráfico de diagrama de puntos para el análisis de los parámetros de dispersión directa A utilizando la dispersión lateral A.Determine las celdas individuales por dispersión lateral utilizando el gráfico de diagrama de puntos para el análisis de la dispersión lateral W en el eje Y y la dispersión lateral H en el eje X. Y determine las celdas individuales por dispersión hacia adelante, utilizando un gráfico de diagrama de puntos, para el análisis de la dispersión hacia adelante W en el eje Y y la dispersión hacia adelante H en el eje X.
Para el análisis de fluorescencia, elija gráficos de diagramas de puntos FL1 utilizando dispersión directa A. Utilice un tubo de poliestireno con tapón que contenga muestras sin etiquetar y muestras previamente etiquetadas con Alexa Fluor 488 de un solo color Y mezcle cuidadosamente el contenido del tubo. Conecte el tubo a la sonda del citómetro de flujo y haga clic con el botón izquierdo en Adquirir. Para configurar la potencia de los láseres, haga clic en Parámetros y, en las opciones a continuación, ajuste el voltaje de la dispersión directa a 182 voltios y el voltaje de la dispersión lateral a 236 voltios.
Para establecer el umbral en el citómetro, haga clic en Umbral y, en las opciones a continuación, ajuste el FSC a 500 voltios. Configure la puerta de análisis para caracterizar las partículas por tamaño y complejidad, así como para realizar análisis de una sola célula. Elimine la autofluorescencia analizando la muestra sin colorante que contiene solo las perlas de látex y ajustando el voltaje del detector FL1 FITC a 332 voltios.
Establezca la puerta de análisis de fluorescencia en formato cuadrangular, a partir del punto negativo que se muestra en el gráfico de diagrama de puntos. Una vez ajustados los análisis morfométricos y fluorescentes, configure el dispositivo para 50.000 eventos y haga clic en Grabar. Aquí se muestran los perfiles electroforéticos del anticuerpo IgY PfHRP2, debido a la separación mediante ácido caprílico.
A partir de esta figura, se puede observar que los anticuerpos antes y después de la separación del ácido caprílico mostraron perfiles electroforéticos similares, con bandas características de 65 kilodaltons y 27 kilodaltons, que se refieren a las cadenas ligeras y pesadas de la IgY. Además de estos, también son visibles otras bandas, probablemente debido al precursor de la proteína vitelogenina II del fragmento terminal C de la yema de huevo. La evaluación de la concentración de saturación de anticuerpos en las perlas de látex es vital para desarrollar un inmunoensayo con las perlas.
Aquí se muestra una curva del porcentaje de fluorescencia de diferentes concentraciones de anticuerpos, acoplada a cada microlitro de perlas de látex comerciales utilizadas. A medida que aumentaba la concentración, los valores porcentuales también aumentaban y se estabilizaban en dos microgramos de concentración de anticuerpos, estableciéndose como la concentración de acoplamiento óptima para el inmunoensayo de antígeno diana. El límite de detección se determinó evaluando el porcentaje de fluorescencia de la reactividad a la velocidad del látex frente a las diferentes concentraciones de la proteína rPfHRP2.
A partir de un inmunoensayo sándwich, se observó que la fluorescencia aumentó de 0,01 microgramos de proteína PfHRP2 y se estabilizó en 0,1 microgramos. No hubo diferencias significativas en la fluorescencia a cero microgramos y 0,01 microgramos. Sin embargo, se observó una diferencia significativa en la fluorescencia a 0,01 microgramos, 0,1 microgramos y 10 microgramos.
El paso de lavado de este protocolo es fundamental para evitar la pérdida de perlas. El calibre debe estar bien definido para que no haya errores en el resultado obtenido. Los pasos aquí descritos representan una estandarización importante, que es necesaria para garantizar la fiabilidad de las pruebas diagnósticas utilizando perlas de látex que se evalúan mediante citometría completa.
Por lo tanto, esta metodología es una alternativa a los modelos clásicos de prueba sándwich. Este método se puede aplicar a diversos tipos de ensayos, y puede ser adecuado para hacer frente a varias moléculas a la superficie de las perlas, así como para la detección de diferentes analitos.
