Tra le tecniche di dosaggio immunologico volte a diagnosticare la malattia, il test citometrico a microsfere è emerso come un approccio altamente sensibile e affidabile, analizzando migliaia di particelle in un singolo test. L'elevata precisione della citometria a flusso, unita al basso costo delle perle di lattice, rendono la nostra tecnica applicabile per l'analisi di strumenti di immunodosaggio, come anticorpi e antigeni. Gli anticorpi IgY hanno un basso costo e vantaggi etici nella loro produzione e possono essere utilizzati come strumento di rilevamento per le malattie rare.
Iniziare immergendo le uova appena deposte o di quattro giorni, del lignaggio bianco Gallus gallus deckle, in una soluzione diluita allo 0,2% di ipoclorito di sodio. Sciacquateli velocemente sotto l'acqua corrente e strofinateli delicatamente. Rompete con cura l'uovo, separate il tuorlo dall'albume con l'aiuto di un separatore di tuorli.
E rimuovere il bianco in eccesso con carta da filtro. Forare il tuorlo e raccoglierne l'interno in un tubo conico da 50 millilitri. Conservare il tuorlo a meno 20 gradi Celsius per almeno 24 ore prima dell'uso.
Dopo aver scongelato il tuorlo immagazzinato, diluirlo in un rapporto di uno a 10 in un PBS millimolare. Regolare il pH della soluzione a cinque, con un normale acido cloridrico, e incubare la soluzione a quattro gradi Celsius per 6-24 ore. Centrifugare la soluzione a 3000 G per 40 minuti e filtrare il surnatante recuperato utilizzando un filtro di cellulosa da 0,7 millimetri, prima di regolare nuovamente il pH del surnatante a cinque.
Aggiungere l'acido caprilico a una concentrazione finale dell'8,7% sotto costante agitazione, per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver centrifugato i campioni per 15 minuti, separare il surnatante dal materiale precipitato. Regolare nuovamente il pH della soluzione a 7,4 utilizzando un molare di idrossido di sodio.
E quantificare gli anticorpi usando il test di Bradford, prima di conservarli a meno 20 gradi Celsius. Aggiungi 21 microlitri di EDC e 21 microlitri di NHS a 21 microlitri di perline di lattice. E regolare a un volume finale di 2,1 millilitri, con PBS filtrato da 10 millimolari.
Incubare la soluzione a 22 gradi Celsius, agitando rapidamente, per tre ore. Aggiungere l'anticorpo di cattura precedentemente estratto, IgY PfHRP2, a diverse microprovette contenenti 100 microlitri di questa soluzione. E incubare di nuovo per 16 ore.
Dopo aver centrifugato i campioni e scartato i surnatanti, lavare due volte le perle di lattice con 500 microlitri di PBS filtrato da 10 millimolari, utilizzando cicli di centrifugazione e risonanza. Per il blocco delle perle, risospendere i campioni in un millilitro di tampone bloccante e seguire la stessa procedura mostrata in precedenza per incubarlo per due ore. Dopo aver lavato le perle con PBS, risuspenderle nuovamente in tampone PBS da 10 millimolari.
Aggiungere 100 microlitri di anticorpo fluorescente anti-pollo, diluito a uno a 2000 in una miscela da 10 millimolari di PBS e BSA, in ciascuna microprovetta. Incubare i campioni al buio per 30 minuti. Dopo aver lavato le perle, risuspenderle nuovamente con 250 microlitri di PBS filtrato da 10 millimolari.
Determinare il limite di rilevazione distribuendo 100 microlitri della preparazione di microsfere bloccate, in provette contenenti diverse quantità della proteina ricombinante diluita PfHRP2 in triplice copia. Incubare le soluzioni di microsfere con la proteina a 22 gradi Celsius, agitando rapidamente, per un'ora. Lavare le perle con 500 microlitri di PBS 10 millimolari filtrato, con centrifugazione, come precedentemente dimostrato.
Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere due microgrammi di anticorpi IgG di topo contro la proteina ricombinante, diluiti in 10 millimolari PBS e BSA a ciascun campione, e seguire la stessa procedura per l'incubazione. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di anticorpo anti-topo fluorescente diluito a ciascun campione. Dopo l'incubazione, risospendere il campione in 250 microlitri di PBS filtrato da 10 millimolari.
Accendere il computer e il citometro a flusso e attendere alcuni minuti affinché l'apparecchiatura si colleghi al computer. Fare clic sul software di citometria installato sul computer e accedere. Dall'area di lavoro del software, selezionare Citometro, Seguito da Avvio fluidico, Modalità di pulizia e SIT Flush.
Definire la strategia di gating in base alle caratteristiche morfometriche e di fluorescenza della particella di controllo negativo. Per determinare la morfometria delle celle, scegliere il grafico del grafico del dot plot per l'analisi dei parametri della dispersione in avanti A utilizzando la dispersione laterale A.Determinare le singole celle in base alla dispersione laterale utilizzando il grafico del grafico del grafico del punto per l'analisi della dispersione laterale W sull'asse Y e della dispersione laterale H nell'asse X. E determinare le singole celle per dispersione in avanti, utilizzando il grafico del grafico a punti, per l'analisi della dispersione in avanti W sull'asse Y e della dispersione in avanti H nell'asse X.
Per l'analisi della fluorescenza, scegliere i grafici a punti FL1 utilizzando la dispersione diretta A.Utilizzare un tubo di polistirene con tappo contenente campioni non etichettati e campioni precedentemente etichettati con Alexa Fluor 488 monocolore E mescolare con cura il contenuto del tubo. Collegare il tubo alla sonda del citometro a flusso e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Acquisisci. Per impostare la potenza dei laser, fare clic su Parametri e, nelle opzioni seguenti, regolare la tensione della dispersione diretta a 182 volt e la tensione della dispersione laterale a 236 volt.
Per impostare la soglia sul citometro, fare clic su Soglia e, nelle opzioni seguenti, regolare l'FSC a 500 volt. Impostare il gate di analisi per caratterizzare le particelle in base alle dimensioni e alla complessità, nonché per eseguire l'analisi di una singola cella. Rimuovere l'autofluorescenza analizzando il campione privo di coloranti contenente solo le perle di lattice e regolando la tensione del rivelatore FL1 FITC a 332 volt.
Impostare il gate di analisi della fluorescenza in formato quadrangolare, dal punto negativo mostrato nel grafico del dot plot. Dopo aver regolato le analisi morfometriche e fluorescenti, configurare il dispositivo per 50.000 eventi e fare clic su Registra. Di seguito sono riportati i profili elettroforetici dell'anticorpo IgY PfHRP2, dovuto alla separazione mediante acido caprilico.
Da questa figura si evince che gli anticorpi prima e dopo la separazione dell'acido caprilico hanno mostrato profili elettroforetici simili, con bande caratteristiche di 65 kilodalton e 27 kilodalton, che si riferiscono alle catene leggere e pesanti delle IgY. Oltre a queste, sono visibili anche altre bande, probabilmente dovute al precursore della proteina del tuorlo d'uovo del frammento terminale C, la vitellogenina II. La valutazione della concentrazione di saturazione degli anticorpi sulle perle di lattice è fondamentale per lo sviluppo di un test immunologico con le perle.
Di seguito è riportata una curva della percentuale di fluorescenza di diverse concentrazioni di anticorpi, accoppiata a ciascun microlitro di perle di lattice commerciali utilizzate. All'aumentare della concentrazione, sono aumentati anche i valori percentuali e si sono stabilizzati a due microgrammi di concentrazione di anticorpi, stabilendo che è la concentrazione di accoppiamento ottimale per il test immunologico dell'antigene target. Il limite di rilevazione è stato determinato valutando la percentuale di fluorescenza della reattività alla velocità del lattice rispetto alle diverse concentrazioni della proteina rPfHRP2.
Da un test immunologico a sandwich, è stato osservato che la fluorescenza è aumentata da 0,01 microgrammi di proteina PfHRP2 e si è stabilizzata a 0,1 microgrammi. Non c'è stata alcuna differenza significativa nella fluorescenza a zero microgrammi e 0,01 microgrammi. Tuttavia, è stata osservata una differenza significativa nella fluorescenza a 0,01 microgrammi, 0,1 microgrammi e 10 microgrammi.
La fase di lavaggio di questo protocollo è fondamentale per evitare la perdita di perline. Il calibro deve essere ben definito in modo che non ci siano errori nel risultato ottenuto. I passaggi qui descritti rappresentano un'importante standardizzazione, necessaria per garantire l'affidabilità dei test diagnostici che utilizzano perle di lattice che vengono valutate tramite citometria completa.
Pertanto, questa metodologia è un'alternativa ai classici modelli di test sandwich. Questo metodo può essere applicato a diversi tipi di saggi e può essere adatto per far fronte a diverse molecole sulla superficie delle microsfere, nonché per la rilevazione di diversi analiti.
