Parmi les techniques d’immunodosage visant à diagnostiquer les maladies, le test cytométrique sur billes s’est imposé comme une approche très sensible et fiable, analysant des milliers de particules en un seul essai. La haute précision de la cytométrie en flux, associée au faible coût des billes de latex, rend notre technique applicable à l’analyse des outils d’immunoessais, tels que les anticorps et les antigènes. Les anticorps IgY ont un faible coût, et les avantages éthiques dans leur production, et peuvent être utilisés comme outil de détection de maladies rares.
Commencez par immerger les œufs fraîchement pondus ou âgés de quatre jours, de la lignée Gallus gallus deckle white, dans une solution diluée à 0,2 % d’hypochlorite de sodium. Rincez-les rapidement à l’eau courante et essuyez-les délicatement. Cassez soigneusement l’œuf, séparez le jaune du blanc à l’aide d’un séparateur de jaunes.
Et retirez l’excédent de blanc avec du papier filtre. Percez le jaune d’œuf et récupérez son intérieur dans un tube conique de 50 millilitres. Conservez le jaune d’œuf à moins 20 degrés Celsius pendant au moins 24 heures avant de l’utiliser.
Après avoir décongelé le jaune stocké, diluez-le dans un rapport de un à 10 dans un PBS millimolaire. Ajustez le pH de la solution à cinq, avec un acide chlorhydrique normal, et incubez la solution à quatre degrés Celsius pendant six à 24 heures. Centrifuger la solution à 3000 G pendant 40 minutes, et filtrer le surnageant récupéré à l’aide d’un filtre en cellulose de 0,7 millimètre, avant de réajuster le pH du surnageant à cinq.
Ajouter l’acide caprylique jusqu’à une concentration finale de 8,7 % en remuant constamment, pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir centrifugé les échantillons pendant 15 minutes, séparez le surnageant du matériau précipité. Réajustez le pH de la solution à 7,4 à l’aide d’une molaire d’hydroxyde de sodium.
Et quantifier les anticorps à l’aide du test de Bradford, avant de les stocker à moins 20 degrés Celsius. Ajoutez 21 microlitres d’EDC et 21 microlitres de NHS à 21 microlitres de billes de latex. Et ajustez à un volume final de 2,1 millilitres, avec du PBS filtré de 10 millimolaires.
Incuber la solution à 22 degrés Celsius, en agitant rapidement, pendant trois heures. Ajouter l’anticorps de capture précédemment extrait, IgY PfHRP2, à différents microtubes contenant 100 microlitres de cette solution. Et incuber à nouveau pendant 16 heures.
Après avoir centrifugé les échantillons et éliminé les surnageants, laver les billes de latex deux fois avec 500 microlitres de PBS filtré de 10 millimolaires, en utilisant des cycles de centrifugation et de remise en suspension. Pour le blocage des billes, remettez les échantillons en suspension dans un millilitre de tampon de blocage et suivez la même procédure que celle indiquée précédemment pour l’incuber pendant deux heures. Après avoir lavé les billes avec du PBS, remettez-les en suspension dans un tampon PBS de 10 millimolaires.
Ajouter 100 microlitres d’anticorps fluorescents anti-poulet, dilués à un à 2000 dans un mélange de 10 millimolaires de PBS et de BSA, dans chaque microtube. Incubez les échantillons dans l’obscurité pendant 30 minutes. Après avoir lavé les billes, remettez-les en suspension avec 250 microlitres de PBS filtré de 10 millimolaires.
Déterminer la limite de détection en distribuant 100 microlitres de la préparation de billes bloquées, dans des tubes contenant différentes quantités de la protéine recombinante diluée PfHRP2 en trois exemplaires. Incuber les solutions de billes avec la protéine à 22 degrés Celsius, en agitant rapidement, pendant une heure. Lavez les billes avec 500 microlitres de PBS filtré de 10 millimolaires, avec centrifugation, comme démontré précédemment.
Après avoir éliminé le surnageant, ajoutez deux microgrammes d’anticorps IgG de souris contre la protéine recombinante, dilués dans 10 millimolaires de PBS et de BSA à chaque échantillon, et suivez la même procédure d’incubation. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’anticorps fluorescent dilué contre la souris à chaque échantillon. Après l’incubation, remettre l’échantillon en suspension dans 250 microlitres de PBS filtré de 10 millimolaires.
Allumez l’ordinateur et le cytomètre en flux, puis attendez quelques minutes que l’équipement se connecte à l’ordinateur. Cliquez sur le logiciel de cytométrie installé sur l’ordinateur et connectez-vous. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre, suivi de Démarrage de la fluidique, Modes de nettoyage et Rinçage SIT.
Définissez la stratégie de déclenchement en fonction des caractéristiques morphométriques et de fluorescence de la particule témoin négative. Pour déterminer la morphométrie des cellules, choisissez le graphique de tracé de points pour l’analyse des paramètres de diffusion vers l’avant A à l’aide de la diffusion latérale A.Déterminez les cellules individuelles par dispersion latérale à l’aide d’un graphique de tracé de points pour l’analyse de la dispersion latérale W sur l’axe Y et de la dispersion latérale H sur l’axe X. Et déterminez les cellules individuelles par diffusion vers l’avant, à l’aide d’un graphique de tracé à points, pour l’analyse de la diffusion vers l’avant W sur l’axe Y et de la diffusion vers l’avant H sur l’axe X.
Pour l’analyse de fluorescence, choisissez des tracés à points FL1 à l’aide d’une diffusion vers l’avant A.Utilisez un tube en polystyrène bouché contenant des échantillons non marqués et des échantillons préalablement étiquetés avec Alexa Fluor 488 unicolore Et mélangez soigneusement le contenu du tube. Fixez le tube à la sonde du cytomètre en flux et cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Acquérir. Pour régler la puissance des lasers, cliquez sur Paramètres, et dans les options ci-dessous, ajustez la tension de la diffusion directe à 182 volts et la tension de la diffusion latérale à 236 volts.
Pour définir le seuil sur le cytomètre, cliquez sur Seuil, et dans les options ci-dessous, ajustez le FSC à 500 volts. Réglez la porte d’analyse pour caractériser les particules en fonction de leur taille et de leur complexité, ainsi que pour effectuer une analyse de cellule unique. Éliminez l’autofluorescence en analysant l’échantillon sans colorant contenant uniquement les billes de latex et en ajustant la tension du détecteur FL1 FITC à 332 volts.
Définissez la porte d’analyse de fluorescence au format quadrangulaire, à partir du point négatif indiqué dans le graphique à points. Une fois les analyses morphométriques et fluorescentes ajustées, configurez l’appareil pour 50 000 événements et cliquez sur Enregistrer. Les profils électrophorétiques de l’anticorps IgY PfHRP2, dû à la séparation à l’aide de l’acide caprylique, sont présentés ici.
Sur cette figure, on peut voir que les anticorps avant et après la séparation de l’acide caprylique présentaient des profils électrophorétiques similaires, avec des bandes caractéristiques de 65 kilodaltons et 27 kilodaltons, qui font référence aux chaînes légères et lourdes de l’IgY. En plus de ceux-ci, d’autres bandes sont également visibles, probablement en raison du précurseur de la vitellogénine II de la protéine du jaune d’œuf du fragment terminal C. L’évaluation de la concentration de saturation en anticorps sur les billes de latex est essentielle pour développer un test immunologique avec les billes.
Une courbe du pourcentage de fluorescence de différentes concentrations d’anticorps, couplée à chaque microlitre de billes de latex commerciales utilisées, est présentée ici. Au fur et à mesure que la concentration augmentait, les valeurs en pourcentage augmentaient également et plafonnaient à deux microgrammes de concentration d’anticorps, ce qui en faisait la concentration de couplage optimale pour le test immunologique de l’antigène cible. La limite de détection a été déterminée en évaluant le pourcentage de fluorescence de la réactivité de la vitesse du latex par rapport à des concentrations variables de la protéine rPfHRP2.
À partir d’un test immunologique sandwich, il a été observé que la fluorescence était passée de 0,01 microgramme de protéine PfHRP2 à un plateau de 0,1 microgramme. Il n’y avait pas de différence significative de fluorescence à zéro microgramme et 0,01 microgramme. Cependant, une différence significative de fluorescence a été observée à 0,01 microgramme, 0,1 microgramme et 10 microgrammes.
L’étape de lavage de ce protocole est critique pour éviter la perte de billes. La jauge doit être bien définie afin qu’il n’y ait pas d’erreurs dans le résultat obtenu. Les étapes décrites ici représentent une standardisation importante, qui est nécessaire pour assurer la fiabilité des tests diagnostiques utilisant des billes de latex qui sont évaluées par cytométrie complète.
Par conséquent, cette méthodologie est une alternative aux modèles de test sandwich classiques. Cette méthode peut être appliquée à divers types de dosages, et peut convenir pour faire face à plusieurs molécules à la surface des billes, ainsi que pour la détection de différents analytes.
