Hastalık teşhisine yönelik immünoassay teknikleri arasında sitometrik boncuk testi, tek bir tahlilde binlerce partikülü analiz ederek oldukça hassas ve güvenilir bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. Akış sitometrisinin yüksek doğruluğu, lateks boncukların düşük maliyeti ile birleştiğinde, tekniğimizi antikorlar ve antijenler gibi immünolojik test araçlarının analizi için uygulanabilir hale getirir. IgY antikorları düşük maliyetlidir ve üretimlerinde etik avantajlara sahiptir ve nadir hastalıklar için bir tespit aracı olarak kullanılabilir.
Gallus gallus deckle beyaz soyundan yeni yumurtlanmış veya dört günlük yumurtaları% 0.2 seyreltilmiş sodyum hipoklorit çözeltisine batırarak başlayın. Akan su altında hızlıca durulayın ve nazikçe silin. Yumurtayı dikkatlice kırın, sarısını bir yumurta sarısı ayırıcı yardımıyla beyazından ayırın.
Ve fazla beyazı filtre kağıdı ile çıkarın. Yumurta sarısını delin ve içini 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Yumurta sarısını kullanmadan önce en az 24 saat eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Depolanan yumurta sarısı çözüldükten sonra, bir milimolar PBS'de bir ila 10 oranında seyreltin. Çözeltinin pH'ını bir normal hidroklorik asit ile beşe ayarlayın ve çözeltiyi altı ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Çözeltiyi 3000 G'de 40 dakika santrifüjleyin ve süpernatantın pH'ını beşe yeniden ayarlamadan önce geri kazanılan süpernatanı 0.7 milimetrelik bir selüloz filtre kullanarak filtreleyin.
Dört santigrat derecede 30 dakika boyunca sürekli karıştırarak% 8.7'lik bir nihai konsantrasyona kaprilik asit ekleyin. Numuneleri 15 dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı çökeltilmiş malzemeden ayırın. Bir molar sodyum hidroksit kullanarak çözeltinin pH'ını 7.4'e yeniden ayarlayın.
Ve eksi 20 santigrat derecede saklamadan önce Bradford testini kullanarak antikorları ölçün. 21 mikrolitre lateks boncuklara 21 mikrolitre EDC ve 21 mikrolitre NHS ekleyin. Ve filtrelenmiş 10 milimolar PBS ile 2,1 mililitrelik son hacme ayarlayın.
Çözeltiyi 22 santigrat derecede, hızlı çalkalayarak üç saat boyunca inkübe edin. Daha önce ekstrakte edilen yakalama antikoru IgY PfHRP2'yi, bu çözeltinin 100 mikrolitresini içeren farklı mikro tüplere ekleyin. Ve tekrar 16 saat inkübe edin.
Numuneleri santrifüjledikten ve süpernatantları attıktan sonra, santrifüjleme ve yeniden süspansiyon döngüleri kullanarak lateks boncukları 500 mikrolitre filtrelenmiş 10 milimolar PBS ile iki kez yıkayın. Boncukların bloke edilmesi için, numuneleri bir mililitre bloke edici tampon içinde yeniden süspanse edin ve iki saat inkübe etmek için daha önce gösterilen prosedürün aynısını izleyin. Boncukları PBS ile yıkadıktan sonra, 10 milimolar PBS tamponunda tekrar süspanse edin.
Her bir mikro tüpe 10 milimolar PBS ve BSA karışımında bir ila 2000'e seyreltilmiş 100 mikrolitre floresan anti-tavuk antikoru ekleyin. Örnekleri karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Boncukları yıkadıktan sonra, 250 mikrolitre filtrelenmiş 10 milimolar PBS ile tekrar süspanse edin.
Bloke edilmiş boncuk preparatının 100 mikrolitresini, farklı miktarlarda seyreltilmiş rekombinant protein PfHRP2'yi üç kopya halinde içeren tüplere dağıtarak tespit sınırını belirleyin. Boncuk çözeltilerini protein ile 22 santigrat derecede, hızlı çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin. Boncukları, daha önce gösterildiği gibi santrifüjleme ile 500 mikrolitre filtrelenmiş 10 milimolar PBS ile yıkayın.
Süpernatanı attıktan sonra, her numuneye 10 milimolar PBS ve BSA'da seyreltilmiş rekombinant proteine karşı iki mikrogram fare IgG antikoru ekleyin ve inkübasyon için aynı prosedürü izleyin. Daha sonra, her numuneye 100 mikrolitre seyreltilmiş floresan anti-fare antikoru ekleyin. İnkübasyondan sonra, numuneyi 250 mikrolitre filtrelenmiş 10 milimolar PBS içinde yeniden süspanse edin.
Bilgisayarı ve akış sitometresini açın ve ekipmanın bilgisayara bağlanması için birkaç dakika bekleyin. Bilgisayarda yüklü olan sitometri yazılımına tıklayın ve oturum açın. Yazılım çalışma alanından Sitometre'yi, ardından Fluidics Başlatma'yı, Temizleme Modları'nı ve SIT Flush'ı seçin.
Negatif kontrol parçacığının morfometrik ve floresan özelliklerine dayalı geçit stratejisini tanımlayın. Hücre morfometrisini belirlemek için, yan dağılım A'yı kullanarak ileri dağılım A parametrelerinin analizi için nokta grafiği grafiğini seçin.Y ekseninde W yan saçılımının ve X ekseninde H yan saçılımının analizi için nokta grafiği grafiğini kullanarak tek hücreleri yan dağılıma göre belirleyin. Ve Y ekseninde ileri dağılım W ve X ekseninde ileri dağılım H analizi için nokta grafiği çizim grafiğini kullanarak tek hücreleri ileri dağılıma göre belirleyin.
Floresan analizi için, ileri saçılma kullanarak FL1 nokta grafiği grafiklerini seçin A.Etiketlenmemiş numuneler ve daha önce tek renkli Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş numuneler içeren durduruculu bir polistiren tüp kullanın ve tüpün içeriğini dikkatlice karıştırın. Tüpü akış sitometresi probuna takın ve Al'a sol tıklayın. Lazerlerin gücünü ayarlamak için Parametreler'e tıklayın ve aşağıdaki seçeneklerde ileri saçılmanın voltajını 182 volta ve yan saçılmanın voltajını 236 volta ayarlayın.
Sitometrede eşiği ayarlamak için Eşik'e tıklayın ve aşağıdaki seçeneklerde FSC'yi 500 volta ayarlayın. Parçacıkları boyut ve karmaşıklığa göre karakterize etmek ve tek hücre analizi yapmak için analiz kapısını ayarlayın. Yalnızca lateks boncukları içeren boyasız numuneyi analiz ederek ve FL1 FITC dedektörünün voltajını 332 volta ayarlayarak otofloresansı giderin.
Floresan analiz kapısını, nokta grafiğinde gösterilen negatif noktadan dörtgen biçimde ayarlayın. Morfometrik ve floresan analizler ayarlandıktan sonra, cihazı 50.000 olay için yapılandırın ve Kaydet'e tıklayın. Kaprilik asit kullanılarak ayrılması nedeniyle IgY PfHRP2 antikorunun elektroforetik profilleri burada gösterilmektedir.
Bu şekilden, kaprilik asit ayrılmasından önceki ve sonraki antikorların, IgY'nin hafif ve ağır zincirlerine atıfta bulunan 65 kilodalton ve 27 kilodaltonluk karakteristik bantlarla benzer elektroforetik profiller gösterdiği görülebilir. Bunlara ek olarak, muhtemelen C terminal fragmanı yumurta sarısı proteini vitellogenin II öncüsü nedeniyle başka bantlar da görülebilir. Lateks boncuklar üzerindeki antikor doygunluk konsantrasyonunun değerlendirilmesi, boncuklarla bir immünolojik test geliştirmek için hayati önem taşır.
Kullanılan ticari lateks boncukların her bir mikrolitresine bağlı farklı antikor konsantrasyonlarının floresan yüzdesinin bir eğrisi burada gösterilmektedir. Konsantrasyon arttıkça, yüzde değerleri de arttı ve iki mikrogram antikor konsantrasyonunda plato haline geldi ve hedef antijen immünolojik testi için optimal birleştirme konsantrasyonu olarak belirlendi. Saptama sınırı, değişen rPfHRP2 protein konsantrasyonlarına karşı lateks hız reaktivitesinin floresan yüzdesi değerlendirilerek belirlendi.
Bir sandviç immünolojik testten, floresansın 0.01 mikrogram PfHRP2 proteininden arttığı ve 0.1 mikrogramda plato olduğu gözlendi. Sıfır mikrogram ve 0.01 mikrogramda floresansta anlamlı bir fark yoktu. Bununla birlikte, floresanda 0.01 mikrogram, 0.1 mikrogram ve 10 mikrogramda önemli bir fark gözlendi.
Bu protokolün yıkama adımı, boncukların kaybını önlemek için kritik öneme sahiptir. Elde edilen sonuçta hata olmaması için gösterge iyi tanımlanmalıdır. Burada açıklanan adımlar, tam sitometri ile değerlendirilen lateks boncuklar kullanılarak yapılan tanı testlerinin güvenilirliğini sağlamak için gerekli olan önemli bir standardizasyonu temsil etmektedir.
Bu nedenle, bu metodoloji klasik sandviç test modellerine bir alternatiftir. Bu yöntem, çeşitli tahlil türlerine uygulanabilir ve boncukların yüzeyine birkaç molekülün çıkarılmasının yanı sıra farklı analitlerin tespiti için uygun olabilir.
