질병 진단을 목표로 하는 면역분석 기술 중 세포측정 비드 분석은 단일 분석에서 수천 개의 입자를 분석하는 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 접근 방식으로 부상했습니다. 유세포 분석의 높은 정확도와 저렴한 라텍스 비드의 저렴한 비용으로 인해 당사의 기술은 항체 및 항원과 같은 면역 분석 도구의 분석에 적용할 수 있습니다. IgY 항체는 저비용, 이의 생산에 있어서 윤리적 이점을 가지며, 희귀 질환에 대한 검출 도구로서 사용될 수 있다.
Gallus gallus deckle 흰색 혈통에서 갓 낳은 알이나 4일 된 알을 0.2% 희석된 차아염소산나트륨 용액에 담그는 것으로 시작합니다. 흐르는 물에 빠르게 헹구고 부드럽게 닦으십시오. 계란을 조심스럽게 깨고 노른자 분리기를 사용하여 노른자를 흰색에서 분리하십시오.
그리고 여과지로 여분의 흰색을 제거하십시오. 노른자를 뚫고 내부를 50 밀리리터의 원추형 튜브에 모으십시오. 사용하기 전에 최소 20시간 동안 노른자를 섭씨 영하 24도에서 보관하십시오.
저장된 노른자를 해동한 후 1밀리몰 PBS에 1:10 비율로 희석합니다. 용액의 pH를 1 개의 일반 염산으로 5로 조정하고 섭씨 4도에서 6 내지 24 시간 동안 용액을 배양한다. 용액을 3000 G에서 40분 동안 원심분리하고, 상청액의 pH를 5로 재조정하기 전에 0.7 밀리미터 셀룰로오스 필터를 사용하여 회수된 상청액을 여과한다.
섭씨 4도에서 30 분 동안 일정한 교반하에 8.7 %의 최종 농도에 카 프릴 산을 첨가한다. 샘플을 15분 동안 원심분리한 후, 침전된 물질로부터 상청액을 분리한다. 1몰 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 7.4로 재조정합니다.
섭씨 영하 20도에서 보관하기 전에 Bradford assay를 사용하여 항체를 정량화합니다. 21 마이크로 리터의 EDC와 21 마이크로 리터의 NHS를 21 마이크로 리터의 라텍스 비드에 첨가하십시오. 그리고 여과된 10밀리몰 PBS를 사용하여 2.1밀리리터의 최종 부피로 조정합니다.
용액을 섭씨 22도에서 3 시간 동안 빠르게 흔들면서 배양합니다. 이전에 추출한 포획 항체인 IgY PfHRP2를 이 용액 100마이크로리터가 들어 있는 다른 마이크로 튜브에 추가합니다. 그리고 16 시간 동안 다시 배양하십시오.
샘플을 원심분리하고 상청액을 버린 후, 원심분리 및 재현탁 사이클을 사용하여 여과된 10밀리몰 PBS 500마이크로리터로 라텍스 비드를 2회 세척합니다. 비드의 블로킹을 위해, 샘플을 1밀리리터의 블로킹 완충액에 재현탁하고, 이전에 나타낸 것과 동일한 절차에 따라 2시간 동안 인큐베이션한다. 비드를 PBS로 세척한 후, 10 밀리몰 PBS 완충액에 다시 재현탁시킨다.
PBS와 BSA의 10 밀리몰 혼합물에서 1 내지 2000으로 희석 된 100 마이크로 리터의 형광 항 닭 항체를 각 마이크로 튜브에 첨가한다. 샘플을 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 비드를 세척한 후, 250 마이크로리터의 여과된 10 밀리몰 PBS로 이들을 다시 현탁시킨다.
100 마이크로리터의 차단된 비드 제제를 서로 다른 양의 희석된 재조합 단백질 PfHRP2를 세 배로 함유하는 튜브에 분배하여 검출 한계를 결정합니다. 단백질과 함께 비드 용액을 섭씨 22도에서 빠르게 진탕하면서 1시간 동안 배양합니다. 이전에 입증된 바와 같이, 원심분리를 이용하여, 여과된 10 밀리몰 PBS의 500 마이크로리터로 비드를 세척한다.
상청액을 버린 후 재조합 단백질에 대해 2 마이크로 그램의 마우스 IgG 항체를 각 샘플에 10 밀리몰 PBS 및 BSA로 희석하고 동일한 배양 절차를 따르십시오. 다음으로, 희석된 형광 항-마우스 항체 100 마이크로리터를 각 샘플에 첨가한다. 인큐베이션 후, 샘플을 250 마이크로리터의 여과된 10 밀리몰 PBS에 재현탁시킨다.
컴퓨터와 유세포 분석기를 켜고 장비가 컴퓨터에 연결될 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 컴퓨터에 설치된 세포 분석 소프트웨어를 클릭하고 로그인하십시오. 소프트웨어 작업 공간에서 Cytometer(유세포분석기)를 선택한 다음 Fluidics Startup(유체 시작), Cleaning Modes(세척 모드) 및 SIT Flush(SIT 플러시)를 선택합니다.
음성 대조 입자의 형태 측정 및 형광 특성을 기반으로 게이팅 전략을 정의합니다. 세포 형태 측정을 결정하려면 측면 산란 A를 사용하여 전방 산란 A 파라미터를 분석하기 위해 도트 플롯 플롯 그래픽을 선택합니다.Y축의 측면 산란 W와 X축의 측면 산란 H를 분석하기 위해 도트 플롯 플롯 그래픽을 사용하여 측면 산란으로 단일 셀을 결정합니다. 그리고 Y축의 전방 산란 W와 X축의 전방 산란 H를 분석하기 위해 도트 플롯 플롯 그래픽을 사용하여 전방 산란으로 단일 세포를 결정합니다.
형광 분석의 경우, 전방 산란을 사용하여 FL1 도트 플롯 플롯을 선택합니다. A.표지되지 않은 샘플, 및 이전에 단색 Alexa Fluor 488로 표지된 샘플을 포함하는 스토퍼된 폴리스티렌 튜브를 사용하고 튜브의 내용물을 조심스럽게 혼합합니다. 튜브를 유세포 분석기 프로브에 부착하고 Acquire(획득)를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 레이저의 출력을 설정하려면 매개 변수를 클릭하고 아래 옵션에서 순방향 산란의 전압을 182 볼트로, 측면 산란의 전압을 236 볼트로 조정하십시오.
세포분석기의 임계값을 설정하려면 임계값을 클릭하고 아래 옵션에서 FSC를 500볼트로 조정합니다. 분석 게이트를 설정하여 크기 및 복잡성에 따라 입자를 특성화하고 단일 세포 분석을 수행합니다. 라텍스 비드만을 함유하는 무색소 시료를 분석하여 자가형광을 제거하고, 검출기 FL1 FITC의 전압을 332 볼트로 조절하였다.
형광 분석 게이트를 도트 플롯 그래프에 표시된 음의 점에서 사각형 형식으로 설정합니다. 형태 측정 및 형광 분석이 조정 된 후 50, 000 이벤트에 대해 장치를 구성하고 기록을 클릭하십시오. 카프릴산을 사용한 분리로 인한 IgY PfHRP2 항체의 전기영동 프로파일이 여기에 나와 있습니다.
이 그림으로부터, 카 프릴 산 분리 전후의 항체는 IgY의 경쇄 및 중쇄를 나타내는 65 킬로 달톤 및 27 킬로 달톤의 특징적인 밴드와 함께 유사한 전기 영동 프로파일을 나타냄을 알 수있다. 이 외에도 C 말단 단편 난황 단백질 vitellogenin II 전구체로 인해 다른 밴드도 볼 수 있습니다. 라텍스 비드에 대한 항체 포화 농도를 평가하는 것은 비드로 면역분석을 개발하는 데 매우 중요합니다.
사용된 상업용 라텍스 비드의 각 마이크로리터에 결합된 상이한 농도의 항체의 형광 백분율의 곡선이 여기에 나와 있습니다. 농도가 증가함에 따라 백분율 값도 증가하고 2마이크로그램의 항체 농도에서 안정되어 표적 항원 면역분석에 대한 최적의 결합 농도로 확립되었습니다. 검출 한계는 다양한 rPfHRP2 단백질 농도에 대한 라텍스 속도 반응성의 형광 백분율을 평가하여 결정되었습니다.
샌드위치 면역검정으로부터, 형광이 0.01 마이크로그램의 PfHRP2 단백질로부터 증가하고, 0.1 마이크로그램에서 정체되는 것이 관찰되었다. 0마이크로그램과 0.01마이크로그램에서 형광에는 유의미한 차이가 없었습니다. 그러나, 형광의 유의한 차이는 0.01 마이크로그램, 0.1 마이크로그램 및 10 마이크로그램에서 관찰되었다.
이 프로토콜의 세척 단계는 비드의 손실을 방지하는 데 중요합니다. 얻은 결과에 실수가 없도록 게이지를 잘 정의해야 합니다. 여기에 설명된 단계는 전체 세포분석을 통해 평가되는 라텍스 비드를 사용한 진단 테스트의 신뢰성을 보장하는 데 필요한 중요한 표준화를 나타냅니다.
따라서이 방법론은 고전적인 샌드위치 테스트 모델의 대안입니다. 이 방법은 다양한 유형의 분석에 적용될 수 있으며 여러 분자를 비드 표면에 대처하고 다양한 분석물을 검출하는 데 적합할 수 있습니다.
