Dentre as técnicas de imunoensaio voltadas para o diagnóstico de doenças, o ensaio citométrico de contas emergiu como uma abordagem altamente sensível e confiável, analisando milhares de partículas em um único ensaio. A alta acurácia da citometria de fluxo, aliada ao baixo custo das esferas de látex, tornam nossa técnica aplicável para a análise de ferramentas de imunoensaios, como anticorpos e antígenos. Os anticorpos IgY têm baixo custo e vantagens éticas em sua produção, podendo ser utilizados como ferramenta de detecção de doenças raras.
Comece mergulhando os ovos recém-postos ou de quatro dias de idade, da linhagem branca Gallus gallus deckle, em uma solução diluída a 0,2% de hipoclorito de sódio. Enxágue-os rapidamente em água corrente e limpe suavemente. Quebre o ovo com cuidado, separe a gema da clara com a ajuda de um separador de gema.
E retire o excesso de branco com papel filtro. Perfure a gema e colete seu interior em um tubo cônico de 50 mililitros. Guarde a gema a menos 20 graus Celsius durante pelo menos 24 horas antes da utilização.
Após descongelar a gema armazenada, dilua-a na proporção de um para 10 em PBS milimolar. Ajustar o pH da solução a cinco, com um ácido clorídrico normal, e incubar a solução a quatro graus Celsius durante seis a 24 horas. Centrifugar a solução a 3000 G durante 40 minutos e filtrar o sobrenadante recuperado utilizando um filtro de celulose 0,7 milímetros, antes de reajustar o pH do sobrenadante para cinco.
Adicionar ácido caprílico a uma concentração final de 8,7% sob agitação constante, durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugar as amostras por 15 minutos, separar o sobrenadante do material precipitado. Reajustar o pH da solução para 7,4 utilizando hidróxido de sódio molar.
E quantificar os anticorpos usando o ensaio de Bradford, antes de armazená-los a 20 graus Celsius negativos. Adicione 21 microlitros de EDC, e 21 microlitros de NHS, a 21 microlitros de contas de látex. E ajustar para um volume final de 2,1 mililitros, com PBS filtrado de 10 milimolares.
Incubar a solução a 22 graus Celsius, com agitação rápida, durante três horas. Adicionar o anticorpo de captura previamente extraído, IgY PfHRP2, a diferentes microtubos contendo 100 microlitros desta solução. E incubar novamente por 16 horas.
Após centrifugar as amostras e descartar os sobrenadantes, lavar duas vezes as esferas de látex com 500 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares, utilizando ciclos de centrifugação e ressuspensão. Para o bloqueio das contas, ressuspenda as amostras em um mililitro de tampão de bloqueio e siga o mesmo procedimento mostrado anteriormente para incubá-las por duas horas. Depois de lavar as contas com PBS, ressuspendê-las novamente em tampão PBS de 10 milimolares.
Adicionar 100 microlitros de anticorpo anti-frango fluorescente, diluídos de um a 2000 em mistura de 10 milimolares de PBS e BSA, a cada microtubo. Incubar as amostras no escuro por 30 minutos. Depois de lavar as contas, ressuspendê-las novamente com 250 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares.
Determinar o limite de detecção distribuindo 100 microlitros da preparação de contas bloqueadas, em tubos contendo diferentes quantidades da proteína recombinante diluída PfHRP2 em triplicata. Incubar as soluções de esferas com a proteína a 22 graus Celsius, com agitação rápida, durante uma hora. Lavar as esferas com 500 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares, com centrifugação, conforme demonstrado anteriormente.
Após o descarte do sobrenadante, adicionar dois microgramas de anticorpo IgG de camundongo contra a proteína recombinante, diluídos em PBS e BSA de 10 milimolares para cada amostra, e seguir o mesmo procedimento de incubação. Em seguida, adicione 100 microlitros do anticorpo anti-camundongo fluorescente diluído a cada amostra. Após a incubação, ressuspender a amostra em 250 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares.
Ligue o computador e o citômetro de fluxo e aguarde alguns minutos para que o equipamento se conecte ao computador. Clique no software de citometria instalado no computador e faça login nele. No espaço de trabalho do software, selecione Citômetro, Seguido por Inicialização de Fluidics, Modos de Limpeza e SIT Flush.
Definir a estratégia de gating com base nas características morfométricas e de fluorescência da partícula de controle negativo. Para determinar a morfometria celular, escolha o gráfico dot plot plot para a análise dos parâmetros de dispersão frontal A usando a dispersão lateral A.Determine as células únicas por dispersão lateral usando o gráfico dot plot plot para a análise da dispersão lateral W no eixo Y e da dispersão lateral H no eixo X. E determinar as células individuais por dispersão direta, usando gráfico de gráfico de gráfico de pontos, para a análise da dispersão direta W no eixo Y e da dispersão H no eixo X.
Para a análise de fluorescência, escolha gráficos de pontos FL1 usando dispersão direta A.Use um tubo de poliestireno com tampa contendo amostras não rotuladas e amostras previamente rotuladas com Alexa Fluor 488 de cor única E misture cuidadosamente o conteúdo do tubo. Conecte o tubo à sonda do citômetro de fluxo e clique com o botão esquerdo em Adquirir. Para definir a potência dos lasers, clique em Parâmetros, e nas opções abaixo, ajuste a tensão do espalhamento para frente para 182 volts, e a tensão do espalhamento lateral para 236 volts.
Para definir o limite no citômetro, clique em Threshold, e nas opções abaixo, ajuste o FSC para 500 volts. Defina a porta de análise para caracterizar partículas por tamanho e complexidade, bem como para realizar análises de célula única. Remova a autofluorescência analisando a amostra sem corante contendo apenas as esferas de látex e ajustando a tensão do detector FL1 FITC para 332 volts.
Defina a porta de análise de fluorescência em formato quadrangular, a partir do ponto negativo mostrado no gráfico de gráfico de pontos. Após o ajuste das análises morfométricas e fluorescentes, configure o dispositivo para 50.000 eventos e clique em Registrar. Os perfis eletroforéticos do anticorpo IgY PfHRP2, devido à separação usando ácido caprílico, são mostrados aqui.
A partir dessa figura, pode-se observar que os anticorpos antes e após a separação do ácido caprílico apresentaram perfis eletroforéticos semelhantes, com bandas características de 65 quilodaltons e 27 quilodaltons, que remetem às cadeias leve e pesada da IgY. Além dessas, outras bandas também são visíveis, provavelmente devido ao fragmento C terminal da proteína vitelogenina II precursora da vitelogenina II. A avaliação da concentração de saturação de anticorpos em esferas de látex é vital para o desenvolvimento de um imunoensaio com as contas.
Uma curva da porcentagem de fluorescência de diferentes concentrações de anticorpos, acoplada a cada microlitro de esferas comerciais de látex utilizadas, é mostrada aqui. À medida que a concentração aumentou, os valores percentuais também aumentaram, e estabilizaram em dois microgramas de concentração de anticorpos, estabelecendo-a como a concentração de acoplamento ideal para o imunoensaio do antígeno alvo. O limite de detecção foi determinado avaliando-se a porcentagem de fluorescência da velocidade de reatividade ao látex contra diferentes concentrações da proteína rPfHRP2.
A partir de um imunoensaio sanduíche, observou-se que a fluorescência foi aumentada a partir de 0,01 microgramas da proteína PfHRP2 e platô em 0,1 microgramas. Não houve diferença significativa na fluorescência a zero microgramas e 0,01 microgramas. No entanto, uma diferença significativa na fluorescência foi observada em 0,01 microgramas, 0,1 microgramas e 10 microgramas.
A etapa de lavagem desse protocolo é fundamental para evitar a perda de miçangas. A bitola deve ser bem definida para que não haja erros no resultado obtido. As etapas aqui descritas representam uma importante padronização, necessária para garantir a confiabilidade dos testes diagnósticos utilizando esferas de látex que são avaliadas por citometria completa.
Portanto, esta metodologia é uma alternativa aos modelos clássicos de teste sanduíche. Este método pode ser aplicado a diversos tipos de ensaios, podendo ser adequado para o enfrentamento de várias moléculas na superfície das contas, bem como para a detecção de diferentes analitos.
