克氏锥虫体外生命周期三个阶段的超微结构扩展显微镜

该协议详细介绍了克氏锥虫（导致恰加斯病的病原体）的三个体外生命周期阶段的超微结构扩展显微镜方法。该协议为当前的超分辨率成像和电子显微镜技术提供了一种替代方案，其优点是与大多数生物实验室和机器核心设施中的传统显微镜兼容。它使用大多数研究实验室的常用技术来获取能够进行三维重建的图像。

该协议促进了锥虫中纳米级结构的研究，允许检查细胞群并以高分辨率对感兴趣细胞的整个体积进行成像。它对于细胞周期和分化瞬时阶段的科学特异性细胞类型特别有用。为了获得更高的分辨率，我们将 ExM 与超分辨率显微技术相结合，以达到 20 纳米以下的分辨率。

首先在补充有 10% FCS 的 LIT 培养基中从对数期培养物中制备克氏锥虫上鞭毛体悬浮液。在室温下以 5， 000 G 离心悬浮液 10 分钟。用 PBS 洗涤沉淀两次，然后重悬于 200 微升 PBS 中。

将悬浮液粘附在涂有聚-D-赖氨酸的 12 毫米圆形盖玻片上，并在室温下孵育 15 至 20 分钟，然后防止交联。在感染后 4 天收集感染锥鞭毛体的 Vero 细胞单层的上清液。使用 Neubauer 细胞计数室，确定锥鞭毛体的浓度。

在室温下以 7， 000 G 离心细胞悬液 10 分钟。在 PBS 中冲洗并重悬细胞后，将细胞悬液转移到赖氨酸包被的盖玻片上，并在室温下孵育盖玻片 10 至 15 分钟，以防止交联。为了从感染的 Vero 细胞中获得无鞭毛体，请在 24 孔组织培养板的底部放置无菌 12 毫米圆形盖玻片。

接下来，在补充有 2% FCS 的 DMEM 中制备 Vero 细胞悬浮液，并将 500 微升悬浮液接种到每个孔中。将板孵育过夜以确保细胞附着。然后，用 500 μL 无菌 PBS 洗涤细胞两次。

将克氏锥虫鞭毛体加入细胞中，并像之前一样孵育 6 小时。首先向 24 孔板的每个孔中加入 0.5 毫升防交联溶液。然后，用粘附寄生虫浸没 12 毫米的 Poly-D-Lysine 涂层盖玻片。

用水填充空孔以减少蒸发后，用密封膜密封板并孵育。为了使样品凝胶化，首先通过在薄纸上放置密封膜，在培养皿中组装一个潮湿室。然后，用水润湿薄纸，并在零下 20 摄氏度下孵育 20 分钟以冷却。

将凉爽潮湿的腔室放在冰上。接下来，使用 3 毫升巴斯德移液管，从 24 孔板的孔中吸出防交联溶液。现在，用镊子取下盖玻片，将它们放在薄纸上，寄生虫朝上。

在试管中取 90 微升单体溶液，并分别加入 5 微升解冻的 TEMED 和 APS。将混合物涡旋 2 到 3 秒钟。在每个盖玻片的密封膜上吸取 35 微升这种混合物，并立即用镊子将盖玻片放在液滴上，寄生虫朝下。

将潮湿室在冰上孵育 5 分钟，然后在 37 摄氏度下孵育 1 小时。首先将两毫升变性溶液移液到六孔板的每个孔中。将含有克氏锥虫寄生虫的凝胶化盖玻片转移到变性溶液中，并在轻轻搅拌下孵育。

促进凝胶分离。使用金属刮刀小心地将凝胶转移到含有 1 毫升变性溶液的 1.5 毫升微量离心管中。在加热块上用固定的盖子孵育试管。

使用 P1000 移液器从微量离心管中吸出变性溶液。用金属刮刀将凝胶转移到装有 10 毫升超纯水的培养皿中，静置 30 分钟。使用 3 ml 一次性巴斯德移液器，更换培养皿中的超纯水，将凝胶在室温下浸没过夜。

第二天，用卡尺测量凝胶直径以计算膨胀。样品可见为平面半透明凝胶，在水中膨胀 4 至 4.5 倍。通过用 PBS 洗涤含有寄生虫的扩增凝胶圈来开始荧光标记。

使用剃须刀片将中心的圆圈切成 10 x 10 毫米的正方形。现在，将每个方块转移到 12 孔板中，并在 500 μL 用 2% PBS 和 BSA 稀释的一抗中孵育，同时振荡。接下来，将凝胶方块在含有 2 毫升 PBS 和 0.1% 聚山梨酯 20 的 6 孔板中孵育 10 分钟，同时振荡。

将凝胶转印到 12 孔板后，加入 500 μL 含 DAPI 的 PBS 二抗溶液，以及每毫升 10 μg NHS 酯偶联到所需荧光团中。将凝胶在 37 摄氏度下轻轻搅拌孵育 2.5 小时。如前所述，在 PBS 聚山梨酯 20 中洗涤凝胶 3 次后，将凝胶转移到装有超纯水的培养皿中，孵育 30 分钟。

将 10 x 10 毫米见方的膨胀凝胶片放在 35 毫米的底部培养皿上。以 10 倍或 20 倍放大倍率检查寄生虫的方向。在具有 63 倍数值孔径的 1.4 倍油浸物镜的共聚焦显微镜中对样品进行成像。

获取 Z 堆栈、每个 Z 步长的宽度和经验确定的每个像素的曝光时间，然后根据需要使用扫描缩放进行有效放大来获取信号强度和采集时间的优化。使用图像处理软件打开 Z 堆栈，并使用每个通道的 Group Z project 选项对堆叠的图像进行分组。然后，选择最大强度投影。

使用 Merge Channels 工具合并图像。选择每个通道的颜色，然后使用处理软件中的"比例尺"工具添加比例尺。初级膨胀提供了 70 纳米的有效分辨率，而二次膨胀显示出大约 4.5 的膨胀因子。

用细胞骨架标志物对 T.cruzi 的所有三个体外生命周期阶段进行染色，显示蛋白质的微管紧身胸衣和鞭毛轴丝定位。用 DAPI 染色时，染色质浓缩清晰区分。与上鞭毛体中泛蛋白质组标记重叠的 α 微管蛋白标志物的免疫定位表明，用抗 α-微管蛋白和 FITC 染色的基底体已经分裂。

泛蛋白质组标记有助于识别所有生命周期阶段的不同寄生虫结构。