这项研究得到了美国国立卫生研究院 （NIH） R01HL147095、R01HL141917 和 R01HL136431、Kowa Company， Ltd. 的研究资助以及欧盟根据 Marie Skłodowska-Curie 资助协议第 101023041 号 （R. Cahalane） 的地平线 2020 研究与创新计划的支持。 图 1 是使用 Biorender.com 创建的。当前的清洁方案是通过修改在 2023 年国际细胞外囊泡学会教育日 （https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI） 上提出的推荐管道清洁方案制定的。非常感谢来自大学健康网络（加拿大多伦多大学）的 Kathryn Howe 博士和 Sneha Raju 博士提供原始颈动脉组织 EV 样本。

1.管道清洗
注意： EV 隔离程序使用有盖和无盖的聚碳酸酯 UC 管（详见下文）。对有盖和无盖的管子都遵循相同的程序。在带盖管的情况下，盖子部件被单独清洁，并在干燥和预储存后重新组装。
<ol><li>在初次使用聚碳酸酯管并取出样品后，立即将 UC 管浸入自来水中，以防止样品干燥到管的侧面。</li>
	<li>将管转移并浸没在自来水中的0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）中10分钟。</li>
	<li>一次一管，从管中倒出大部分（但不是全部）SDS溶液，并使用棉签彻底擦拭EV颗粒所在的管子区域。 注意：请勿使用带有刷毛的任何东西。该协议使用普通棉签;但是，可以使用专门的低绒棉签来清洁管子。</li>
	<li>用热自来水 （~50 °C） 冲洗至少 3 次。确保完全填充和倒出管子。</li>
	<li>使用喷雾瓶或窄口洗瓶用软化水冲洗 1 次。</li>
	<li>使用喷雾瓶用 70% 乙醇冲洗 1 次。</li>
	<li>将管子倒置晾干。 注意：用于荧光激活细胞分选的试管架非常适合干燥 UC 试管。</li>
	<li>将完全干燥的试管放入干净的罐子中;它们可以重复使用。 注意：目前，该协议已验证可重复使用多达 2 倍。</li>
</ol>2. 电动汽车浓缩
注：以下 EV 分离和蛋白质组学方案用于原始组织 EV 分离，以及用于获得空白（从未使用过）和清洁管样品的“模拟样品”。原始样本是来自接受颈动脉内膜切除术的患者的颈动脉斑块的重悬组织捕获的 EV。手术标本是从大学健康网络（加拿大多伦多）收集的，并得到了机构伦理委员会的批准。根据《赫尔辛基宣言》，所有患者都对样本采集和数据分析提供了知情同意书。模拟样品是用与EV分离样品相同的溶液和处理步骤处理空白管和清洁管而获得的伪颗粒。
<ol><li>在冰上解冻 EV 样品或 PBS 中的模拟样品。</li>
	<li>制备NTE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.137M NaCl pH 7.4）和无菌过滤器。</li>
	<li>将样品在4°C下以10,000× g 旋转10分钟。</li>
	<li>将上清液移入 1 mL 开顶聚碳酸酯管中。</li>
	<li>将上清液在4°C下以100,000×g 离心1小时。</li>
	<li>将沉淀重悬于 150 μL 无菌过滤的带有蛋白酶抑制剂的 NTE 缓冲液中。</li>
	<li>转移到 1.5 mL 微量离心管中，加入 NTE 缓冲液以达到 1.5 mL 的总样品体积。</li>
	<li>将样品放在冰上。</li>
</ol>3. 密度梯度的制备和密度梯度分离
注意：Blaser 等人之前已简要描述过此 EV 隔离协议9：
<ol><li>用NTE缓冲液作为稀释剂制备五种碘克沙醇密度梯度培养基（10%、15%、20%、25%和30%）溶液。</li>
	<li>将五种密度溶液依次分层在有盖的超速离心管中，30%在底部，10%在顶部。</li>
	<li>将盖子固定在管子上，并在室温下轻轻移动到稳定的水平位置 1 小时。</li>
	<li>1小时后，将试管轻轻移动到冰上的垂直位置30分钟以冷却梯度。</li>
	<li>将 1.5 mL 样品或模拟样品（NTE 缓冲液）添加到制备的密度梯度管的顶部。</li>
	<li>在4°C下以250,000× g 超速离心管40分钟。</li>
	<li>将密度梯度 （2.4 mL） 的顶部部分移至未加盖的超速离心管中。用无菌过滤的 NTE 缓冲液填充至 9 mL。</li>
	<li>通过在4°C下以100,000× g 超速离心1小时来沉淀EV。 注意： 用标记圈出可见 EV 颗粒的位置或预期位置。这将使您能够直接用棉签清洁颗粒区域。</li>
	<li>吸出上清液，同时将试管移动到倒置位置3分钟。用棉签取出剩余的液滴，然后将管子右侧朝上转动。</li>
	<li>将 EV 沉淀重悬于参考试剂盒中的 12 μL 裂解缓冲液中。</li>
</ol>4. 蛋白质组学的多肽制备
注：蛋白质组学样品制备根据试剂盒方案进行，对低丰度蛋白质样品进行了内部修改。修改后的协议如下：
<ol><li>通过在95°C的裂解缓冲液中加热10分钟来裂解，变性，还原和烷基化样品。</li>
	<li>使用来自样品的10μL裂解溶液和10μL消化溶液在37°C下使用Lys-C /胰蛋白酶消化溶液消化样品2小时。</li>
	<li>通过洗去亲水性和疏水性污染物，并使用试剂盒溶液洗脱纯化的肽，通过小柱纯化肽。</li>
	<li>在45°C的快速真空中干燥纯化的肽45分钟或直至干燥。 注意：避免肽过度干燥。</li>
	<li>将样品储存在-80°C，直到质谱测序时。</li>
	<li>向干燥的肽中加入 17 μL 载 LC 溶液。</li>
	<li>将样品放在冰上1小时。</li>
	<li>短暂涡旋样品，然后在超声水浴中超声处理 5 分钟。</li>
	<li>将 LC 负载样品以 16,000 × g 离心 1 分钟，从顶部吸出 15 μL，然后分离到新管中。</li>
</ol>5.液相色谱和串联质谱测序
<ol><li>将 2 μL LC 负载肽溶液注入质谱仪。</li>
	<li>使用双柱设置分离肽。</li>
	<li>在45°C的恒定温度下加热色谱柱。</li>
	<li>以 300 nL/min 的速度从 5% 至 21% 溶剂 B（乙腈/0.1% 甲酸）运行 60 分钟，然后使用 21% 至 30% 溶剂 B 运行 10 分钟，再运行 10 分钟的 95%-5% 拼图清洗。</li>
	<li>将 MS1 分辨率设置为 120 K（最大进样时间，25 ms），将顶部母离子（在 3.0 s 循环时间内）置于 HCD 分离宽度 1.2 m/z，启用动态排除（60 s），并将 MS2 分辨率设置为 60 K（最大进样时间，自动;归一化碰撞能量，24%、26% 和 28%）。</li>
	<li>将 MS1 和 MS2 采集范围分别设置为 400 m/z-1,200 m/z 和 120 m/z-1,200 m/z。</li>
</ol>6. 肽/蛋白质鉴定
<ol><li>使用蛋白质组学搜索软件，使用商业搜索算法与人类 uniProt 数据库进行搜索获得的肽谱。</li>
	<li>将消化酶设置为胰蛋白酶，并允许最多两次遗漏的裂解。</li>
	<li>将母离子耐受性设置为10 ppm，将碎片耐受性窗口设置为0.02 Da。</li>
	<li>将蛋氨酸氧化和N-末端乙酰化设置为可变修饰，将半胱氨酸脲甲基化设置为固定修饰。</li>
	<li>根据 Percolator 算法计算的 1.0% 的假发现率 （FDR） 阈值过滤肽。</li>
	<li>仅考虑分配给一个给定蛋白质组且未在任何其他蛋白质组中检测到的肽是唯一的，并将它们用于进一步分析。</li>
	<li>在分析中，每种蛋白质至少包含两个独特的肽。</li>
	<li>通过母离子检测最大限度地提高 ID。</li>
	<li>进行色谱比对，最大保留时间偏移为 10 min，质量耐受为 10 ppm，最小信噪比为 5。</li>
	<li>通过总肽量归一化肽丰度。</li>
</ol>

用于蛋白质组学的聚碳酸酯超速离心管的高效回收

<ol>
	<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. 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J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+human+milk-derived+extracellular+vesicles+unveils+a+novel+functional+proteome+distinct+from+other+milk+components.">Comprehensive proteomic analysis of human milk-derived extracellular vesicles unveils a novel functional proteome distinct from other milk components.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (11), 3412-3423 (2016).</li><li>Blaser, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+of+tissue+extracellular+vesicles+identifies+unique+modulators+of+atherosclerosis+and+calcific+aortic+valve+stenosis.">Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis.</a> Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).</li><li>Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+cationic+peptides+to+solid+surfaces+of+glass+and+plastic.">Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic.</a> PLOS ONE. 10 (5), e0122419 (2015).</li><li>Use and care of centrifuge tubes and bottles. Beckman Coulter Available from: <a target="_blank" href="https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles">https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles</a> (2014)</li><li>Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+quantifying+polycarbonate+and+polyethylene+terephthalate+microplastics+in+environmental+samples+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).</li><li>Schittek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermcidin:+a+novel+human+antibiotic+peptide+secreted+by+sweat+glands.">Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).</li><li>Blaydon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+CSTA,+encoding+Cystatin+A,+underlie+exfoliative+ichthyosis+and+reveal+a+role+for+this+protease+inhibitor+in+cell-cell+adhesion.">Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).</li><li>Henry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hornerin+is+a+component+of+the+epidermal+cornified+cell+envelopes.">Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes.</a> FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).</li><li>Bolling, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+ichthyotic+peeling+skin+syndrome+due+to+FLG2+mutations.">Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).</li><li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMP+molecules+S100A9+and+S100A8+activated+by+IL-17A+and+house-dust+mites+are+increased+in+atopic+dermatitis.">DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis.</a> Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).</li><li>Gl&#228;ser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+protein+psoriasin+(S100A7)+is+upregulated+in+atopic+dermatitis+and+after+experimental+skin+barrier+disruption.">The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).</li><li>Molhave, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=House+dust+in+seven+Danish+offices.">House dust in seven Danish offices.</a> Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).</li><li>Buschow, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-associated+proteins+in+B-cell+exosomes+and+potential+functional+implications+for+exosome+biogenesis.">MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).</li></ol>

作者没有要披露的利益冲突。

在这里，我们描述并验证了一种用于清洁聚碳酸酯 UC 管以用于 EV 富集和蛋白质组学应用的协议。我们证明了与低于该质谱采集方案检测限的清洁假颗粒分析相比，成功地从先前的 UC 管样品中去除了残留蛋白质，并显示了与清洁的 UC 管假颗粒相比，从未使用过的空白 UC 管的蛋白质组相似性。
首先，为了防止蛋白质无意中吸附到聚碳酸酯内壁上，将UC管立即浸没在H2O<s...

细胞外囊泡 （EV） 是从细胞中释放的脂质双层分隔颗粒，携带生物活性货物（如蛋白质）并参与各种生物过程，包括细胞间通讯和生物矿化的形成1。这些颗粒存在于所有体液和组织中，它们的生物活性和用途是一个快速发展的科学研究领域。由于这些纳米颗粒的尺寸小且与其他颗粒（如脂质体和蛋白质聚集体）的生物相似性，这些纳米颗粒的分离和验证带来了各种挑战。最新的国际细胞外囊泡学会指南，2018 年细胞外囊泡研究的最小信息 （MISEV2018），是公认的 EV 科学研究标准2。
根据上游源和下游应用的不同，必须使用各种方法（通常同时使用）进行 EV 隔离。截至 2015 年，电动汽车最常见的主要隔离方法是差速超速离心 （UC）2。原则上，初始低速离心会分离出更大或更密集的不需要的成分，例如细胞和细胞碎片，从而将 EV 留在上清液中。随后，UC 使用非常高的离心力将其颗粒化，从而将 EV 从其他较小或密度较小的颗粒中分离和纯化，但这些颗粒也可能包含致密的非 EV 颗粒。大多数协议通常会在某个步骤中使用 UC 将 EV 与流体隔离3。此外，UC 还用于其他 EV 分离方法，例如密度梯度超速离心 （DGUC），它使用 OptiprepTM 碘沙醇和离心力等介质根据其浮力密度分离 EV4。存在其他 EV 隔离方法3.
考虑到对 EV 所决定的生物过程的理解的快速发展及其作为生物标志物和病理生理学信息的潜力，蛋白质组学等基于发现的分析已经获得了关注 5,6,7,8。EV 体积小，与全组织或细胞裂解物相比，蛋白质产量低 （<1 μg），具体取决于来源。用于蛋白质组学分析的 EV 分离需要特殊考虑，例如从上游液体或组织中去除非 EV 蛋白污染物，在分离过程中考虑 EV 蛋白降解，以及使用创建与肽制备和质谱分析化学相容的蛋白质溶液的方法。
研究实验室消耗品通常是塑料和一次性的。这些一次性材料加剧了全球塑料污染危机和消耗品成本。专用的聚碳酸酯和聚苯乙烯 UC 管设计用于承受实验室应用中颗粒 EV 所需的高离心力。虽然可以对 UC 管进行灭菌和消毒以供重复使用，但蛋白质组学分析，尤其是蛋白质产量低的蛋白质组学分析，如 EV，需要特别注意。不仅要充分去除先前使用中的残留蛋白质，还必须考虑与质谱和塑料衍生聚合物污染的化学相容性。
在这里，我们提出了一种使用适用于质谱分析的洗涤剂的聚碳酸酯管的清洁方案，并进行了实验以验证其成功去除了低于检测限的残留蛋白质和缺乏可检测的聚合物污染物。为了验证使用 UC 和 DGUC 目的的 EV 蛋白质组学应用的清洁方案，我们获得了使用联合 UC 和 DGUC 方案从人脉管组织 EV 分离物中获得的试管。使用所描述的方案清洁试管，并且在没有样品的情况下重复实验过程，比较从未使用的空白UC管和清洁的UC管。最终，验证适用于电动汽车富集的UC管清洁协议将减少电动汽车实验室产生的废物，并降低与此类实验相关的成本。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355630</td>
			<td>uncapped ultracentrifuge tube(s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355603</td>
			<td>capped ultracentrifuge tube(s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 &#181;m x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 &#181;m x 250 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>164946 and ES902</td>
			<td>Dual column setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Swab Swab, Cotton Head</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89031-270</td>
			<td>cotton swab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. &#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BRE725533</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Human database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreOmics iST kit &#160;</td>
			<td>PreOmics</td>
			<td>P.O.00027</td>
			<td>commercial protein sample preparation kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer &#160;package (PD, Version 2.5)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>Proteomic search software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEQUEST-HT search algorithm&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Search algorithm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (20%)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-230</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polycarbonate ultracentrifuge tube re-use in proteomic analyses of extracellular vesicles

一次性实验室塑料加剧了污染危机，并增加了消耗品成本。在细胞外囊泡 （EV） 分离中，聚碳酸酯超速离心机 （UC） 管用于承受相关的高离心力。EV 蛋白质组学是一个先进的领域，缺乏针对这些管的经过验证的重复使用协议。将耗材重复用于低产量蛋白质分离方案和下游蛋白质组学需要试剂与质谱采集兼容，例如没有离心管衍生的合成聚合物污染，并充分去除残留蛋白质。
该协议描述并验证了一种清洁聚碳酸酯UC管以在EV蛋白质组学实验中重复使用的方法。清洁过程包括立即将 UC 管浸入 H2O 中以防止蛋白质干燥，用 0.1% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 洗涤剂洗涤，在热自来水、软化水和 70% 乙醇中冲洗。为了验证下游 EV 蛋白质组学的 UC 管重用方案，在使用差分 UC 和密度梯度分离从心血管组织中分离 EV 的实验后获得了使用过的管。清洁试管并在没有 EV 样品的情况下重复实验过程，将从未使用的空白 UC 试管与清洁的 UC 试管进行比较。从分离程序中获得的假 EV 沉淀被裂解并制备用于液相色谱-串联质谱法，使用商业蛋白质样品制备试剂盒进行修饰，适用于低丰度蛋白质样品。
清洁后，与来自同一管的先前 EV 分离样品相比，假沉淀中鉴定出的蛋白质数量减少了 98%。将清洁的试管与空白试管进行比较，两种样品都含有非常少量的蛋白质 （≤20），相似度为 86%。确认清洁管的色谱图中没有聚合物峰。最终，验证适用于电动汽车富集的UC管清洁协议将减少电动汽车实验室产生的废物并降低实验成本。

Extracellular vesicles (EVs) are lipid-bilayer-delimited particles released from cells that carry biologically active cargo, such as protein, and participate in various biological processes, including cell-cell communication and the formation of biologic mineralization1. These particles are found in all body fluids and tissues, and their biological activities and uses are a rapidly evolving field of scientific research. Isolation and validation of these nanoparticles present various challenges due to their small size and bio-similarity to other particles, such as liposomes and protein aggregates. The most recent International Society of Extracellular Vesicles guidelines, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), are the recognized standard for EV scientific research2.
Various methods, often in tandem, must be used for EV isolation depending on the upstream source and the downstream applications. As of 2015, the most common primary isolation method for EVs was differential ultracentrifugation (UC)2. In principle, initial lower speed centrifugation separates&#160;larger or denser unwanted components, such as cells and cell debris, leaving EVs in the supernatant. Subsequently, UC uses very high centrifugal force to pellet out and thus separate and purify EVs from other particles that are smaller or less dense but which may also contain dense non-EV particles. Most protocols will often use, at one step or another, UC to isolate EVs from a fluid3. Further, UC is used in other methods of EV isolation, such as density gradient ultracentrifugation (DGUC), which uses mediums such as OptiprepTM iodixanol and centrifugal force to separate EVs according to their buoyant density4. Other methods of EV isolation exist3.
Considering the rapidly evolving understanding of the biological processes dictated by EVs and their potential as biomarkers and information regarding pathophysiology, discovery-based analyses such as proteomics have gained traction5,6,7,8. EVs are small, and, depending on the source, have a low yield of protein (&#60;1 &#956;g) when compared to whole tissue or cell lysate. Isolation of EVs for proteomics analysis requires special considerations, such as the removal of non-EV protein contaminants from upstream liquid or tissue, consideration of EV protein degradation during the isolation process, and the utilization of methods that create protein solutions that are chemically compatible with peptide preparation and mass spectrometry analyses.
Research laboratory consumables are often plastic and disposable in nature. These single-use materials contribute to the global plastic pollution crisis and consumable costs. Specialized polycarbonate and polystyrene UC tubes are designed to withstand the high centrifugal forces required to pellet EVs in laboratory applications. While it is possible to sterilize and disinfect UC tubes for re-use, proteomic analysis, especially those of low protein yields such as EVs, requires special attention. Not only is sufficient removal of residual protein from the previous use paramount, chemical compatibility with mass-spectroscopy and plastic-derived polymer contamination must also be considered.
Here we present a cleaning protocol of polycarbonate tubes using detergents suitable for mass-spectrometry and perform experiments to validate its successful removal of residual protein below limits of detection and lack of detectable polymer contaminants. To validate the cleaning protocol for EV proteomic applications using both UC and DGUC purposes, we obtained tubes from isolations of human vasculature tissue EVs with a combined UC and DGUC protocol. Tubes were cleaned using the protocol described, and the experimental process was repeated without samples comparing a blank never-used UC tube and a cleaned UC tube. Ultimately, the validation of a UC tube cleaning protocol suitable for the enrichment of EVs will reduce the waste produced by EV laboratories and lower the cost associated with such experiments.

作者聚焦：有效重复使用聚碳酸酯管进行细胞外囊泡分离

聚碳酸酯超速离心管在细胞外囊泡蛋白质组学分析中的重复使用

We study cardiovascular diseases, specifically the role of extracellular vesicles in the pathological calcification of cardiovascular tissues, such as valves and blood vessels. Researchers in our group have recently defined methods to extract tissue and trapped extracellular vesicles from fibro calcific cardiovascular tissue to determine their proteomic profile. Our group has demonstrated that these extracellular vesicles contain important protein cargo for initiating calcification in disease tissues.The specialized tubes used in the ultracentrifugation step of extracellular vesicle isolation can be cleaned and sterilized for reuse. However, proteomic analysis requires special consideration as any contamination could greatly affect downstream results. Here we validate a protocol for reusing consumables, specifically polycarbonate ultracentrifuge tubes for extracellular vesicle isolation that is suitable for downstream low input proteomics applications.Our protocol is simple and effective, and it will allow researchers to reduce both the consumable costs and the waste typically associated with these isolation protocols.

为了验证清洁方案（图1），进行了两个实验。首先，将来自清洁管的“模拟样本”的蛋白质组与来自管初次使用的组织 EV 样本的蛋白质组进行比较，以确定已鉴定蛋白质的残留。代表性色谱图显示，清洁试管后峰非均一性降低（图2）。在最初的 EV 分离中，用两种或多种独特的肽鉴定了 806 种蛋白质。清洁后，鉴定出的蛋白质数量减少了 98%，达到 19 ?...

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提供了详细的方案，用于清洁和重复使用聚碳酸酯超速离心管以执行适用于蛋白质组学实验的细胞外囊泡分离。

Single-use laboratory plastics exacerbate the pollution crisis and contribute to consumable costs. In extracellular vesicle (EV) isolation, polycarbonate ...

我们研究心血管疾病，特别是细胞外囊泡在心血管组织（如瓣膜和血管）病理性钙化中的作用。我们小组的研究人员最近定义了从纤维钙化心血管组织中提取组织和捕获细胞外囊泡的方法，以确定其蛋白质组学特征。我们的团队已经证明，这些细胞外囊泡含有重要的蛋白质货物，用于启动疾病组织中的钙化。在细胞外囊泡分离的超速离心步骤中使用的专用试管可以进行清洁和灭菌，以便重复使用。然而，蛋白质组学分析需要特别考虑，因为任何污染都会极大地影响下游结果。在这里，我们验证了一种重复使用消耗品的方案，特别是用于细胞外囊泡分离的聚碳酸酯超速离心管，适用于下游低输入蛋白质组学应用。我们的实验方案简单有效，它将使研究人员能够降低消耗品成本和通常与这些分离实验方案相关的浪费。

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Research

JoVE Journal

Biology

Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles

623 次观看.  Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School. 我们研究心血管疾病，特别是细胞外囊泡在心血管组织（如瓣膜和血管）病理性钙化中的作用。我们小组的研究人员最近定义了从纤维钙化心血管组织中提取组织和捕获细胞外囊泡的方法，以确定其蛋白质组学特征。我们的团队已经证明，这些细胞外囊泡含有重要的蛋白质货物，用于启动疾病组织中的钙化。在细胞外囊泡分离的超速离心步骤中使用的专用试管可以进行?...