Diese Studie wurde durch ein Forschungsstipendium der National Institutes of Health Grants (NIH) R01HL147095, R01HL141917 und R01HL136431, Kowa Company, Ltd. und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie-Skłodowska-Curie-Grant Agreement Nr. 101023041 (R. Cahalane) unterstützt. Abbildung 1 wurde mit Biorender.com erstellt. Das aktuelle Reinigungsprotokoll wurde durch die Änderung eines empfohlenen Schlauchreinigungsprotokolls entwickelt, das auf dem Bildungstag der International Society of Extracellular Vesicles 2023 (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) vorgestellt wurde. Vielen Dank an Dr. Kathryn Howe und Dr. Sneha Raju vom University Health Network (University of Toronto, Kanada) für die originalen EV-Proben des Karotisgewebes.

1. Reinigung der Rohre
HINWEIS: Bei dem EV-Isolationsverfahren werden sowohl verschlossene als auch unverschlossene Polycarbonat-UC-Schläuche verwendet (siehe unten). Das gleiche Verfahren wurde sowohl für verschlossene als auch für unverschlossene Röhrchen angewendet. Bei verschlossenen Tuben wurden die Deckelteile einzeln gereinigt und nach der Trocknung und Vorlagerung wieder zusammengebaut.
<ol><li>Tauchen Sie die UC-Röhrchen nach der ersten Verwendung der Polycarbonat-Röhrchen und der Entnahme der Probe sofort in Leitungswasser, um ein Austrocknen der Probe an der Seite des Röhrchens zu verhindern.</li>
	<li>Röhrchen in 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) in Leitungswasser geben und 10 min lang eintauchen.</li>
	<li>Delambieren Sie nacheinander den größten Teil, aber nicht die gesamte SDS-Lösung aus dem Rohr und wischen Sie mit einem Wattestäbchen den Bereich des Rohrs, in dem sich das EV-Pellet befand, gründlich ab. HINWEIS: Verwenden Sie keine Gegenstände mit Borsten. Für dieses Protokoll wurden normale Wattestäbchen verwendet; Für die Reinigung der Röhrchen können jedoch spezielle, fusselarme Wattestäbchen verwendet werden.</li>
	<li>Mindestens 3x mit heißem Leitungswasser (~50 °C) nachspülen. Achten Sie darauf, die Tube vollständig zu füllen und zu dekantieren.</li>
	<li>1x mit demineralisiertem Wasser mit einer Sprühflasche oder einer Enghals-Waschflasche spülen.</li>
	<li>1x mit 70%igem Ethanol in einer Sprühflasche spülen.</li>
	<li>Lassen Sie die Tube kopfüber trocknen. HINWEIS: Röhrchengestelle für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung eignen sich gut zum Trocknen der UC-Röhrchen.</li>
	<li>Legen Sie die vollständig getrockneten Röhrchen in ein sauberes Glas; Sie sind bereit für die Wiederverwendung. HINWEIS: Derzeit ist das Protokoll für die Wiederverwendung von bis zu 2x validiert.</li>
</ol>2. EV-Anreicherung
HINWEIS: Das folgende EV-Isolations- und Proteomik-Protokoll wurde sowohl für die ursprüngliche Gewebe-EV-Isolierung als auch für die "Scheinproben" verwendet, die zur Gewinnung der leeren (nie verwendeten) und gereinigten Röhrchenproben verwendet wurden. Bei den ursprünglichen Proben handelte es sich um resuspendierte, in Gewebe eingeklemmte EVs aus Karotis-Plaques von Patienten, die sich einer Karotis-Endarterektomie unterzogen hatten. Die chirurgischen Proben wurden vom University Health Network (Toronto, Kanada) entnommen und von der institutionellen Ethikkommission genehmigt. Alle Patienten gaben ihre Einverständniserklärung zur Probenentnahme und Datenanalyse in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki. Bei den Scheinproben handelte es sich um Pseudopellets, die durch die Behandlung von leeren und gereinigten Röhrchen mit den gleichen Lösungen und Verarbeitungsschritten wie die EV-Isolationsproben gewonnen wurden.
<ol><li>Tauen Sie EV-Proben oder Scheinproben in PBS auf Eis auf.</li>
	<li>Stellen Sie einen NTE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) und einen Sterilfilter her.</li>
	<li>Die Proben bei 10.000 × g für 10 min bei 4 °C schleudern.</li>
	<li>Den Überstand in ein oben offenes 1-ml-Polycarbonat-Röhrchen umfüllen.</li>
	<li>Der Überstand wird bei 100.000× g 1 h bei 4 °C zentrifugiert.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 150 μl sterilfiltriertem NTE-Puffer mit Proteaseinhibitor.</li>
	<li>In ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und NTE-Puffer hinzufügen, um ein Gesamtprobenvolumen von 1,5 ml zu erreichen.</li>
	<li>Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.</li>
</ol>3. Vorbereitung von Dichtegradienten und Trennung von Dichtegradienten
HINWEIS: Dieses EV-Isolationsprotokoll wurde bereits von Blaser et al. beschrieben.9 In Kürze:
<ol><li>Bereiten Sie fünf Lösungen von Iodixanol Density Gradient Medium (10 %, 15 %, 20 %, 25 % und 30 %) mit NTE-Puffer als Verdünnungsmittel vor.</li>
	<li>Schichten Sie die fünf Dichtelösungen nacheinander in verschlossene Ultrazentrifugenröhrchen, wobei 30 % unten und 10 % oben liegen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Kappen auf den Röhrchen und bringen Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur vorsichtig in eine stabile horizontale Position.</li>
	<li>Bewegen Sie nach 1 h die Röhre(n) 30 Minuten lang vorsichtig in eine vertikale Position auf dem Eis, um das Gefälle abzukühlen.</li>
	<li>Geben Sie 1,5 mL der Probe oder Scheinprobe (NTE-Puffer) auf die Oberseite der vorbereiteten Dichtegradientenröhrchen.</li>
	<li>Ultrazentrifugenröhrchen mit 250.000 × g für 40 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie die oberen Fraktionen des Dichtegradienten (2,4 ml) zu den unverschlossenen Ultrazentrifugenröhrchen. Auf 9 mL mit steril gefiltertem NTE-Puffer auffüllen.</li>
	<li>Pelletieren Sie die Elektrofahrzeuge durch Ultrazentrifugieren bei 100.000 × g für 1 h bei 4 °C. HINWEIS: Kreisen Sie die Position des sichtbaren EV-Pellets oder die erwartete Position mit einer Markierung ein. Auf diese Weise können Sie den Bereich des Pellets direkt mit dem Tupfer reinigen.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an, während Sie den Schlauch 3 Minuten lang auf den Kopf stellen. Entfernen Sie die restlichen Tröpfchen mit einem Wattestäbchen, bevor Sie das Röhrchen mit der rechten Seite nach oben drehen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das EV-Pellet in 12 μl Lysepuffer im referenzierten Kit.</li>
</ol>4. Peptidpräparat für die Proteomik
HINWEIS: Die Proteomik-Probenvorbereitung wurde gemäß dem Kit-Protokoll mit internen Modifikationen für Proteinproben mit geringer Abundanz durchgeführt. Das geänderte Protokoll lautet wie folgt:
<ol><li>Die Proben werden durch 10 Minuten Erhitzen in Lysepuffer bei 95 °C lysiert, denaturiert, reduziert und alkylatiert.</li>
	<li>Die Proben werden 2 h lang bei 37 °C mit der Lys-C/Trypsin-Aufschlusslösung unter Verwendung von 10 μl Lyselösung aus der Probe und 10 μl der Aufschlusslösung aufgeschlossen.</li>
	<li>Reinigen Sie Peptide durch eine Kartusche, indem Sie hydrophile und hydrophobe Verunreinigungen auswaschen und gereinigte Peptide mit Kit-Lösungen eluieren.</li>
	<li>Trocknen Sie die gereinigten Peptide im Schnellvakuum bei 45 °C für 45 min oder bis sie trocken sind. HINWEIS: Vermeiden Sie ein Übertrocknen der Peptide.</li>
	<li>Lagern Sie die Proben bis zum Zeitpunkt der Massenspektrometrie-Sequenzierung bei -80 °C.</li>
	<li>Geben Sie 17 μl LC-Load-Lösung zu den getrockneten Peptiden.</li>
	<li>Lassen Sie die Proben 1 h auf Eis.</li>
	<li>Die Proben kurz vortexen und dann 5 min in einem Ultraschall-Wasserbad beschallen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die LC-geladenen Proben 1 Minute lang bei 16.000 × g , saugen Sie 15 μl von oben an und trennen Sie sie in ein neues Röhrchen.</li>
</ol>5. Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie-Sequenzierung
<ol><li>Injizieren Sie 2 μl LC-geladene Peptidlösung in ein Massenspektrometer.</li>
	<li>Fraktionieren Sie die Peptide mit einem Dual-Säulen-Setup.</li>
	<li>Die Säule auf eine konstante Temperatur von 45 °C erhitzen.</li>
	<li>Führen Sie den analytischen Gradienten bei 300 nL/min von 5 % auf 21 % Lösungsmittel B (Acetonitril/0,1 % Ameisensäure) für 60 Minuten durch, gefolgt von 10 Minuten mit 21 % bis 30 % Lösungsmittel B und weiteren 10 Minuten mit einer 95 %-5 %-Stichsäge.</li>
	<li>Stellen Sie die MS1-Auflösung auf 120 K ein (maximale Injektionszeit, 25 ms), setzen Sie die Top-Vorläufer-Ionen (innerhalb einer Zykluszeit von 3,0 s) einer HCD-Isolationsbreite von 1,2 m/z aus, dynamischer Ausschluss aktiviert (60 s), und stellen Sie die MS2-Auflösung auf 60 K ein (maximale Injektionszeit, automatisch; normalisierte Kollisionsenergie, 24 %, 26 % und 28 %).</li>
	<li>Stellen Sie den Erfassungsbereich von MS1 und MS2 auf 400 m/z-1.200 m/z bzw. 120 m/z-1.200 m/z ein.</li>
</ol>6. Identifizierung von Peptiden/Proteinen
<ol><li>Durchsuchen Sie die erfassten Peptidspektren mit einer proteomischen Suchsoftware unter Verwendung eines kommerziellen Suchalgorithmus gegen eine humane uniProt-Datenbank.</li>
	<li>Stellen Sie das Verdauungsenzym auf Trypsin ein und lassen Sie bis zu zwei fehlende Spaltungen zu.</li>
	<li>Legen Sie die Toleranz des Vorgängers auf 10 ppm und das Fenster für die Fragmenttoleranz auf 0,02 Da fest.</li>
	<li>Methioninoxidation und N-terminale Acetylierung als variable Modifikationen und Cysteincarbamidomethylierung als feste Modifikation einstellen.</li>
	<li>Filtern Sie die Peptide basierend auf einem Schwellenwert (False Discovery Rate) von 1,0 %, der vom Percolator-Algorithmus berechnet wird.</li>
	<li>Betrachten Sie nur Peptide, die einer bestimmten Proteingruppe zugeordnet sind und in keiner anderen Proteingruppe nachgewiesen wurden, als einzigartig und verwenden Sie sie für weitere Analysen.</li>
	<li>Nehmen Sie nur mindestens zwei einzigartige Peptide für jedes Protein in die Analysen auf.</li>
	<li>Maximieren Sie IDs mit der Erkennung von Vorläuferionen.</li>
	<li>Führen Sie eine chromatographische Ausrichtung mit einer maximalen Retentionszeitverschiebung von 10 Minuten, einer Massentoleranz von 10 ppm und einem Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 5 durch.</li>
	<li>Normalisieren Sie die Peptidhäufigkeit nach der Gesamtpeptidmenge.</li>
</ol>

Effizientes Recycling von Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen für die Proteomik

<ol>
	<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. 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J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+human+milk-derived+extracellular+vesicles+unveils+a+novel+functional+proteome+distinct+from+other+milk+components.">Comprehensive proteomic analysis of human milk-derived extracellular vesicles unveils a novel functional proteome distinct from other milk components.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (11), 3412-3423 (2016).</li><li>Blaser, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+of+tissue+extracellular+vesicles+identifies+unique+modulators+of+atherosclerosis+and+calcific+aortic+valve+stenosis.">Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis.</a> Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).</li><li>Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+cationic+peptides+to+solid+surfaces+of+glass+and+plastic.">Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic.</a> PLOS ONE. 10 (5), e0122419 (2015).</li><li>Use and care of centrifuge tubes and bottles. Beckman Coulter Available from: <a target="_blank" href="https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles">https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles</a> (2014)</li><li>Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+quantifying+polycarbonate+and+polyethylene+terephthalate+microplastics+in+environmental+samples+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).</li><li>Schittek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermcidin:+a+novel+human+antibiotic+peptide+secreted+by+sweat+glands.">Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).</li><li>Blaydon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+CSTA,+encoding+Cystatin+A,+underlie+exfoliative+ichthyosis+and+reveal+a+role+for+this+protease+inhibitor+in+cell-cell+adhesion.">Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).</li><li>Henry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hornerin+is+a+component+of+the+epidermal+cornified+cell+envelopes.">Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes.</a> FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).</li><li>Bolling, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+ichthyotic+peeling+skin+syndrome+due+to+FLG2+mutations.">Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).</li><li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMP+molecules+S100A9+and+S100A8+activated+by+IL-17A+and+house-dust+mites+are+increased+in+atopic+dermatitis.">DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis.</a> Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).</li><li>Gl&#228;ser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+protein+psoriasin+(S100A7)+is+upregulated+in+atopic+dermatitis+and+after+experimental+skin+barrier+disruption.">The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).</li><li>Molhave, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=House+dust+in+seven+Danish+offices.">House dust in seven Danish offices.</a> Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).</li><li>Buschow, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-associated+proteins+in+B-cell+exosomes+and+potential+functional+implications+for+exosome+biogenesis.">MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Hier beschreiben und validieren wir ein Protokoll für die Reinigung von Polycarbonat-UC-Rohren für EV-Anreicherungs- und Proteomik-Anwendungen. Wir zeigten die erfolgreiche Entfernung von Restprotein aus der vorherigen UC-Röhrchenprobe im Vergleich zu einer gereinigten Pseudo-Pellet-Analyse unterhalb der Nachweisgrenze dieses Massenspektrometrie-Erfassungsprotokolls und zeigten die proteomische Ähnlichkeit von leeren, nie benutzten UC-Röhrchen im Vergleich zu gereinigten UC-Röhrchen-Pseudopellets.
<p class="jov...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Lipid-Doppelschicht-abgegrenzte Partikel, die von Zellen freigesetzt werden, die biologisch aktive Fracht, wie z. B. Proteine, transportieren und an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich der Zell-Zell-Kommunikation und der Bildung biologischer Mineralisation1. Diese Partikel kommen in allen Körperflüssigkeiten und Geweben vor, und ihre biologischen Aktivitäten und Verwendungen sind ein sich schnell entwickelndes Gebiet der wissenschaftlichen Forschung. Die Isolierung und Validierung dieser Nanopartikel stellt aufgrund ihrer geringen Größe und Bioähnlichkeit mit anderen Partikeln wie Liposomen und Proteinaggregaten verschiedene Herausforderungen dar. Die neuesten Richtlinien der International Society of Extracellular Vesicles, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), sind der anerkannte Standard für die wissenschaftliche Forschung im Bereich EV2.
Für die EV-Isolierung müssen je nach vorgelagerter Quelle und nachgeschalteten Anwendungen verschiedene Methoden, oft im Tandem, verwendet werden. Im Jahr 2015 war die gebräuchlichste primäre Isolationsmethode für EVs die differentielle Ultrazentrifugation (UC)2. Im Prinzip trennt die anfängliche Zentrifugation mit niedrigerer Geschwindigkeit größere oder dichtere unerwünschte Bestandteile wie Zellen und Zelltrümmer, so dass EVs im Überstand verbleiben. Anschließend verwendet UC eine sehr hohe Zentrifugalkraft, um EVs auszupelletieren und somit von anderen Partikeln zu trennen und zu reinigen, die kleiner oder weniger dicht sind, aber auch dichte Nicht-EV-Partikel enthalten können. Die meisten Protokolle verwenden häufig in dem einen oder anderen Schritt UC, um EVs aus einer Flüssigkeit zu isolieren3. Darüber hinaus wird UC in anderen Methoden der EV-Isolierung verwendet, wie z. B. der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DGUC), bei der Medien wie OptiprepTM Iodixanol und Zentrifugalkraft verwendet werden, um EVs entsprechend ihrer Auftriebsdichtezu trennen 4. Es gibt auch andere Methoden der EV-Isolierung3.
In Anbetracht des sich schnell entwickelnden Verständnisses der biologischen Prozesse, die von EVs diktiert werden, und ihres Potenzials als Biomarker und Informationen zur Pathophysiologie haben forschungsbasierte Analysen wie die Proteomik an Bedeutung gewonnen 5,6,7,8. EVs sind klein und haben je nach Quelle eine geringe Proteinausbeute (<1 μg) im Vergleich zu Ganzgewebe- oder Zelllysat. Die Isolierung von EVs für die Proteomik-Analyse erfordert besondere Überlegungen, wie z. B. die Entfernung von Nicht-EV-Proteinverunreinigungen aus der vorgelagerten Flüssigkeit oder dem Gewebe, die Berücksichtigung des EV-Proteinabbaus während des Isolierungsprozesses und die Verwendung von Methoden zur Herstellung von Proteinlösungen, die chemisch mit Peptidpräparations- und Massenspektrometrieanalysen kompatibel sind.
Verbrauchsmaterialien für Forschungslabore sind oft aus Kunststoff und Einweg. Diese Einwegmaterialien tragen zur globalen Plastikverschmutzungskrise und zu den Kosten für Verbrauchsmaterialien bei. Spezialisierte UC-Rohre aus Polycarbonat und Polystyrol sind so konzipiert, dass sie den hohen Zentrifugalkräften standhalten, die zum Pelletieren von Elektrofahrzeugen in Laboranwendungen erforderlich sind. Während es möglich ist, UC-Röhrchen für die Wiederverwendung zu sterilisieren und zu desinfizieren, erfordert die proteomische Analyse, insbesondere bei niedrigen Proteinausbeuten wie z. B. EVs, besondere Aufmerksamkeit. Nicht nur die ausreichende Entfernung von Proteinresten aus der vorherigen Verwendung ist von größter Bedeutung, sondern auch die chemische Verträglichkeit mit Massenspektroskopie und kunststoffbedingter Polymerkontamination muss berücksichtigt werden.
Hier stellen wir ein Reinigungsprotokoll von Polycarbonattuben mit massenspektrometrischen Detergenzien vor und führen Experimente durch, um die erfolgreiche Entfernung von Proteinresten unterhalb der Nachweisgrenzen und das Fehlen von nachweisbaren Polymerverunreinigungen zu validieren. Um das Reinigungsprotokoll für proteomische EV-Anwendungen sowohl mit UC- als auch mit DGUC-Zwecken zu validieren, erhielten wir Röhrchen aus Isolationen von EVs aus humanem Gefäßgewebe mit einem kombinierten UC- und DGUC-Protokoll. Die Röhrchen wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls gereinigt, und der experimentelle Prozess wurde ohne Proben wiederholt, bei denen eine leere, nie verwendete UC-Röhre mit einer gereinigten UC-Röhre verglichen wurde. Letztendlich wird die Validierung eines UC-Rohrreinigungsprotokolls, das für die Anreicherung von Elektrofahrzeugen geeignet ist, den von EV-Labors produzierten Abfall reduzieren und die mit solchen Experimenten verbundenen Kosten senken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355630</td>
			<td>uncapped ultracentrifuge tube(s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355603</td>
			<td>capped ultracentrifuge tube(s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 &#181;m x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 &#181;m x 250 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>164946 and ES902</td>
			<td>Dual column setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Swab Swab, Cotton Head</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89031-270</td>
			<td>cotton swab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. &#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BRE725533</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Human database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreOmics iST kit &#160;</td>
			<td>PreOmics</td>
			<td>P.O.00027</td>
			<td>commercial protein sample preparation kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer &#160;package (PD, Version 2.5)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>Proteomic search software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEQUEST-HT search algorithm&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Search algorithm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (20%)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-230</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polycarbonate ultracentrifuge tube re-use in proteomic analyses of extracellular vesicles

Einweg-Laborkunststoffe verschärfen die Verschmutzungskrise und tragen zu den Kosten für Verbrauchsmaterialien bei. Bei der Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EV) werden Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen (UC) verwendet, um den damit verbundenen hohen Zentrifugalkräften standzuhalten. Die EV-Proteomik ist ein fortschrittliches Gebiet, und es fehlen validierte Wiederverwendungsprotokolle für diese Röhrchen. Die Wiederverwendung von Verbrauchsmaterialien für Proteinisolierungsprotokolle mit geringer Ausbeute und nachgeschaltete Proteomik erfordert die Kompatibilität der Reagenzien mit Massenspektroskopie-Akquisitionen, wie z. B. das Fehlen einer Kontamination durch synthetische Polymere aus Zentrifugenröhrchen und eine ausreichende Entfernung von Restproteinen.
Dieses Protokoll beschreibt und validiert eine Methode zur Reinigung von Polycarbonat-UC-Röhrchen für die Wiederverwendung in EV-Proteomik-Experimenten. Der Reinigungsprozess umfasst das sofortige Eintauchen der UC-Schläuche in H2O, um ein Austrocknen der Proteine zu verhindern, das Waschen in 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS)-Reinigungsmittel, das Spülen in heißem Leitungswasser, demineralisiertem Wasser und 70 % Ethanol. Um das Protokoll zur Wiederverwendung von UC-Röhrchen für die nachgeschaltete EV-Proteomik zu validieren, wurden verwendete Röhrchen nach einem Experiment gewonnen, bei dem EVs aus kardiovaskulärem Gewebe mittels differentieller UC- und Dichtegradiententrennung isoliert wurden. Die Röhrchen wurden gereinigt und der experimentelle Prozess wurde ohne EV-Proben wiederholt, wobei leere, nie verwendete UC-Röhrchen mit gereinigten UC-Röhrchen verglichen wurden. Die aus den Isolationsverfahren gewonnenen Pseudo-EV-Pellets wurden lysiert und für die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines kommerziellen Proteinprobenvorbereitungskits mit Modifikationen für Proteinproben mit geringer Abundanz vorbereitet.
Nach der Reinigung wurde die Anzahl der identifizierten Proteine im Pseudo-Pellet im Vergleich zur vorherigen EV-Isolationsprobe aus demselben Röhrchen um 98 % reduziert. Beim Vergleich eines gereinigten Röhrchens mit einem leeren Röhrchen enthielten beide Proben eine sehr geringe Anzahl von Proteinen (≤20) mit einer Ähnlichkeit von 86 %. Das Fehlen von Polymerpeaks in den Chromatogrammen der gereinigten Röhren wurde bestätigt. Letztendlich wird die Validierung eines Reinigungsprotokolls für UC-Röhren, das für die Anreicherung von Elektrofahrzeugen geeignet ist, den von den EV-Labors produzierten Abfall reduzieren und die Versuchskosten senken.

Extracellular vesicles (EVs) are lipid-bilayer-delimited particles released from cells that carry biologically active cargo, such as protein, and participate in various biological processes, including cell-cell communication and the formation of biologic mineralization1. These particles are found in all body fluids and tissues, and their biological activities and uses are a rapidly evolving field of scientific research. Isolation and validation of these nanoparticles present various challenges due to their small size and bio-similarity to other particles, such as liposomes and protein aggregates. The most recent International Society of Extracellular Vesicles guidelines, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), are the recognized standard for EV scientific research2.
Various methods, often in tandem, must be used for EV isolation depending on the upstream source and the downstream applications. As of 2015, the most common primary isolation method for EVs was differential ultracentrifugation (UC)2. In principle, initial lower speed centrifugation separates&#160;larger or denser unwanted components, such as cells and cell debris, leaving EVs in the supernatant. Subsequently, UC uses very high centrifugal force to pellet out and thus separate and purify EVs from other particles that are smaller or less dense but which may also contain dense non-EV particles. Most protocols will often use, at one step or another, UC to isolate EVs from a fluid3. Further, UC is used in other methods of EV isolation, such as density gradient ultracentrifugation (DGUC), which uses mediums such as OptiprepTM iodixanol and centrifugal force to separate EVs according to their buoyant density4. Other methods of EV isolation exist3.
Considering the rapidly evolving understanding of the biological processes dictated by EVs and their potential as biomarkers and information regarding pathophysiology, discovery-based analyses such as proteomics have gained traction5,6,7,8. EVs are small, and, depending on the source, have a low yield of protein (&#60;1 &#956;g) when compared to whole tissue or cell lysate. Isolation of EVs for proteomics analysis requires special considerations, such as the removal of non-EV protein contaminants from upstream liquid or tissue, consideration of EV protein degradation during the isolation process, and the utilization of methods that create protein solutions that are chemically compatible with peptide preparation and mass spectrometry analyses.
Research laboratory consumables are often plastic and disposable in nature. These single-use materials contribute to the global plastic pollution crisis and consumable costs. Specialized polycarbonate and polystyrene UC tubes are designed to withstand the high centrifugal forces required to pellet EVs in laboratory applications. While it is possible to sterilize and disinfect UC tubes for re-use, proteomic analysis, especially those of low protein yields such as EVs, requires special attention. Not only is sufficient removal of residual protein from the previous use paramount, chemical compatibility with mass-spectroscopy and plastic-derived polymer contamination must also be considered.
Here we present a cleaning protocol of polycarbonate tubes using detergents suitable for mass-spectrometry and perform experiments to validate its successful removal of residual protein below limits of detection and lack of detectable polymer contaminants. To validate the cleaning protocol for EV proteomic applications using both UC and DGUC purposes, we obtained tubes from isolations of human vasculature tissue EVs with a combined UC and DGUC protocol. Tubes were cleaned using the protocol described, and the experimental process was repeated without samples comparing a blank never-used UC tube and a cleaned UC tube. Ultimately, the validation of a UC tube cleaning protocol suitable for the enrichment of EVs will reduce the waste produced by EV laboratories and lower the cost associated with such experiments.

Autor im Rampenlicht: Effektive Wiederverwendung von Polycarbonat-Rohren für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Wiederverwendung von Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen bei proteomischen Analysen extrazellulärer Vesikel

Um das Reinigungsprotokoll (Abbildung 1) zu validieren, wurden zwei Experimente durchgeführt. Zunächst wurde das Proteom der "Scheinprobe" aus dem gereinigten Röhrchen mit dem Proteom der Gewebe-EV-Probe aus der ersten Verwendung des Röhrchens verglichen, um die Verschleppung der identifizierten Proteine zu bestimmen. Repräsentative Chromatogramme zeigen eine Verringerung der Peakheterogenität nach Reinigung der Röhrchen (Abbildung 2). In der ursprünglic...

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Es wird ein detailliertes Protokoll für die Reinigung und Wiederverwendung von Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen zur Durchführung einer extrazellulären Vesikelisolierung bereitgestellt, die für Proteomik-Experimente geeignet ist.

Single-use laboratory plastics exacerbate the pollution crisis and contribute to consumable costs. In extracellular vesicle (EV) isolation, polycarbonate ...

Wir untersuchen kardiovaskuläre Erkrankungen, insbesondere die Rolle extrazellulärer Vesikel bei der pathologischen Verkalkung von kardiovaskulärem Gewebe wie Klappen und Blutgefäßen. Forscher in unserer Gruppe haben kürzlich Methoden zur Extraktion von Gewebe und eingeschlossenen extrazellulären Vesikeln aus fibrokalkhaltigem Herz-Kreislauf-Gewebe definiert, um ihr proteomisches Profil zu bestimmen. Unsere Gruppe hat gezeigt, dass diese extrazellulären Vesikel eine wichtige Proteinfracht enthalten, um die Verkalkung im Krankheitsgewebe zu initiieren.Die Spezialröhrchen, die im Ultrazentrifugationsschritt der extrazellulären Vesikelisolierung verwendet werden, können für die Wiederverwendung gereinigt und sterilisiert werden. Die proteomische Analyse erfordert jedoch eine besondere Überlegung, da jede Kontamination die nachgelagerten Ergebnisse stark beeinträchtigen kann. Hier validieren wir ein Protokoll für die Wiederverwendung von Verbrauchsmaterialien, insbesondere Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen für die extrazelluläre Vesikelisolierung, das für nachgelagerte Proteomik-Anwendungen mit geringem Input geeignet ist.Unser Protokoll ist einfach und effektiv und ermöglicht es den Forschern, sowohl die Kosten für Verbrauchsmaterialien als auch den Abfall zu reduzieren, der typischerweise mit diesen Isolationsprotokollen verbunden ist.

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Research

JoVE Journal

Biology

Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles

719 Aufrufe.  Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School. Wir untersuchen kardiovaskuläre Erkrankungen, insbesondere die Rolle extrazellulärer Vesikel bei der pathologischen Verkalkung von kardiovaskulärem Gewebe wie Klappen und Blutgefäßen. Forscher in unserer Gruppe haben kürzlich Methoden zur Extraktion von Gewebe und eingeschlossenen extrazellulären Vesikeln aus fibrokalkhaltigem Herz-Kreislauf-Gewebe definiert, um ihr proteomisches Profil zu bestimmen. Unsere Gruppe hat gezeigt, dass diese extrazellulären Vesikel eine wichtige Proteinfr...

Serie: Autor im Rampenlicht: Effektive Wiederverwendung von Polycarbonat-Rohren für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Single-use laboratory plastics exacerbate the pollution crisis and contribute to consumable costs. In extracellular vesicle (EV) isolation, polycarbonate ultracentrifuge (UC) tubes are used to endure the associated high centrifugal forces. EV proteomics is an advancing field and validated re-use protocols for these tubes are lacking. Re-using consumables for low-yield protein isolation protocols and downstream proteomics requires reagent compatibility with mass spectroscopy acquisitions, such as the absence of centrifuge tube-derived synthetic polymer contamination, and sufficient removal of residual proteins.
This protocol describes and validates a method for cleaning polycarbonate UC tubes for re-use in EV proteomics experiments. The cleaning process involves immediate submersion of UC tubes in H2O to prevent protein drying, washing in 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent, rinsing in hot tap water, demineralized water, and 70% ethanol. To validate the UC tube re-use protocol for downstream EV proteomics, used tubes were obtained following an experiment isolating EVs from cardiovascular tissue using differential UC and density gradient separation. Tubes were cleaned and the experimental process was repeated without EV samples comparing blank never-used UC tubes to cleaned UC tubes. The pseudo-EV pellets obtained from the isolation procedures were lysed and prepared for liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a commercial protein sample preparation kit with modifications for low-abundance protein samples.
Following cleaning, the number of identified proteins was reduced by 98% in the pseudo-pellet versus the previous EV isolation sample from the same tube. Comparing a cleaned tube against a blank tube, both samples contained a very small number of proteins (&#8804;20) with 86% similarity. The absence of polymer peaks in the chromatograms of the cleaned tubes was confirmed. Ultimately, the validation of a UC tube cleaning protocol suitable for the enrichment of EVs will reduce the waste produced by EV laboratories and lower the experimental costs.

A detailed protocol is provided for cleaning and re-using polycarbonate ultracentrifuge tubes to perform extracellular vesicle isolation suitable for proteomics experiments.