Este estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do National Institutes of Health grants (NIH) R01HL147095, R01HL141917 e R01HL136431, Kowa Company, Ltd. e do Programa de Pesquisa e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o Acordo de Concessão Marie Skłodowska-Curie nº 101023041 (R. Cahalane). A Figura 1 foi criada com Biorender.com. O protocolo de limpeza atual foi desenvolvido modificando um protocolo de limpeza de tubo recomendado apresentado no Dia da Educação da Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares 2023 (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI). Muito obrigado à Dra. Kathryn Howe e à Dra. Sneha Raju da University Health Network (Universidade de Toronto, Canadá) pelas amostras originais de EV do tecido carotídeo.

1. Limpeza do tubo
NOTA: O procedimento de isolamento EV usa tubos UC de policarbonato com e sem tampa (detalhados abaixo). O mesmo procedimento foi seguido para tubos tampados e não tampados. No caso de tubos tampados, as partes da tampa foram limpas individualmente e remontadas após a secagem e pré-armazenamento.
<ol><li>Após o uso inicial dos tubos de policarbonato e a remoção da amostra, mergulhe imediatamente os tubos UC em água da torneira para evitar o ressecamento da amostra na lateral do tubo.</li>
	<li>Transfira e submerja os tubos em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% em água da torneira por 10 min.</li>
	<li>Um tubo de cada vez, transvase a maior parte, mas não toda, da solução SDS do tubo e use um cotonete para limpar completamente a área do tubo onde o pellet EV estava localizado. NOTA: Não use nada com cerdas. Este protocolo usou cotonetes normais; no entanto, cotonetes especializados e de baixa emissão de fiapos podem ser usados para limpar os tubos.</li>
	<li>Enxágue pelo menos 3x com água quente da torneira (~ 50 °C). Certifique-se de encher e decantar completamente o tubo.</li>
	<li>Enxágüe 1x com água desmineralizada usando um borrifador ou um frasco de lavagem de boca estreita.</li>
	<li>Enxágue 1x com etanol a 70% usando um borrifador.</li>
	<li>Deixe o tubo de cabeça para baixo para secar. NOTA: Os racks de tubos para classificação de células ativadas por fluorescência funcionam bem para secar os tubos UC.</li>
	<li>Coloque os tubos completamente secos em uma jarra limpa; eles estão prontos para reutilização. NOTA: Atualmente, o protocolo é validado para reutilização em até 2x.</li>
</ol>2. Enriquecimento de EV
NOTA: O seguinte protocolo de isolamento EV e proteômica foi usado tanto para o isolamento EV do tecido original, quanto para as "amostras simuladas" usadas para obter as amostras de tubo em branco (nunca usadas) e limpas. As amostras originais foram EVs ressuspensas aprisionadas em tecido de placas carotídeas de pacientes submetidos a endarterectomias carotídeas. As peças cirúrgicas foram coletadas na University Health Network (Toronto, Canadá) e aprovadas pelo comitê de ética institucional. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para a coleta de amostras e análise dos dados, de acordo com a Declaração de Helsinque. As amostras simuladas foram pseudo-pellets obtidos do tratamento de tubos em branco e limpos com as mesmas soluções e etapas de processamento das amostras de isolamento EV.
<ol><li>Descongele amostras EV ou amostras simuladas em PBS no gelo.</li>
	<li>Faça tampão NTE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) e filtro estéril.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 10 000 × g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Mova o sobrenadante para um tubo de policarbonato aberto de 1 mL.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante a 100.000× g durante 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em 150 μL de tampão NTE filtrado estéril com inibidor de protease.</li>
	<li>Transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione tampão NTE para atingir um volume total de amostra de 1,5 mL.</li>
	<li>Mantenha as amostras no gelo.</li>
</ol>3. Preparação de gradientes de densidade e separação de gradientes de densidade
NOTA: Este protocolo de isolamento EV foi descrito anteriormente por Blaser et al.9 Em resumo:
<ol><li>Prepare cinco soluções de meio de gradiente de densidade de iodixanol (10%, 15%, 20%, 25% e 30%) com tampão NTE como diluente.</li>
	<li>Colocar as soluções de cinco densidades sequencialmente no(s) tubo(s) de ultracentrífuga tampado(s) com 30% na parte inferior e 10% na parte superior.</li>
	<li>Fixe as tampas no(s) tubo(s) e mova-as suavemente para uma posição horizontal estável durante 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após 1 h, mova o(s) tubo(s) suavemente para a posição vertical no gelo por 30 min para esfriar o gradiente.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL da amostra ou amostra simulada (tampão NTE) ao topo do(s) tubo(s) de gradiente de densidade preparado(s).</li>
	<li>Tubo(s) de ultracentrífuga a 250.000 × g durante 40 min a 4 °C.</li>
	<li>Remova as frações superiores do gradiente de densidade (2.4 mL) para o(s) tubo(s) de ultracentrífuga destampado(s). Encha até 9 mL com tampão NTE filtrado estéril.</li>
	<li>Pulverizar os EVs por ultracentrifugação a 100.000 × g por 1 h a 4 °C. NOTA: Circule a localização do pellet EV visível ou a localização esperada com um marcador. Isso permitirá que você limpe a área do pellet diretamente com o cotonete.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante enquanto move o tubo para uma posição de cabeça para baixo por 3 min. Remova as gotículas restantes com um cotonete antes de virar o tubo para cima.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet EV em 12 μL de tampão de lise no kit referenciado.</li>
</ol>4. Preparação de peptídeos para proteômica
NOTA: A preparação da amostra proteômica foi realizada de acordo com o protocolo do kit com modificações internas para amostras de proteína de baixa abundância. O protocolo modificado é o seguinte:
<ol><li>Lise, desnature, reduza e alquile as amostras aquecendo em tampão de lise a 95 °C por 10 min.</li>
	<li>Digerir as amostras utilizando a solução de digestão de Lis-C/tripsina durante 2 h a 37 °C, utilizando 10 μl de solução de lise da amostra e 10 μl da solução de digestão.</li>
	<li>Purifique os peptídeos através de um cartucho, lavando os contaminantes hidrofílicos e hidrofóbicos e eluindo os peptídeos purificados usando soluções de kit.</li>
	<li>Seque os peptídeos purificados em vácuo rápido a 45 °C por 45 min ou até secar. NOTA: Evite o ressecamento dos peptídeos.</li>
	<li>Armazenar amostras a -80 °C até ao momento da sequenciação por espectrometria de massa.</li>
	<li>Adicione 17 μL de solução de carga LC aos peptídeos secos.</li>
	<li>Deixe as amostras no gelo por 1 h.</li>
	<li>Vortex as amostras brevemente e depois sonicar em banho-maria ultrassônico por 5 min.</li>
	<li>Centrifugue as amostras de carga LC a 16.000 × g por 1 min, aspire 15 μL do topo e separe em um novo tubo.</li>
</ol>5. Cromatografia líquida e sequenciamento por espectrometria de massa em tandem
<ol><li>Injectar 2 μL de solução de peptídeo de carga LC num espectrómetro de massas.</li>
	<li>Fracione os peptídeos usando uma configuração de coluna dupla.</li>
	<li>Aquecer a coluna a uma temperatura constante de 45 °C.</li>
	<li>Execute o gradiente analítico a 300 nL/min de 5% a 21% de Solvente B (acetonitrila/0,1% de ácido fórmico) por 60 min, seguido por 10 min de 21% a 30% de Solvente B e outros 10 min de uma lavagem de quebra-cabeça de 95% a 5%.</li>
	<li>Defina o MS1 para resolução de 120 K (tempo máximo de injeção, 25 ms), sujeite os principais íons precursores (dentro de um tempo de ciclo de 3.0 s) para largura de isolamento HCD de 1.2 m/z, exclusão dinâmica habilitada (60 s) e defina a resolução MS2 para 60 K (tempo máximo de injeção, automático; energia de colisão normalizada, 24%, 26% e 28%).</li>
	<li>Defina a faixa de aquisição MS1 e MS2 para 400 m/z-1.200 m/z e 120 m/z-1.200 m/z, respectivamente.</li>
</ol>6. Identificação de peptídeos/proteínas
<ol><li>Pesquise os espectros de peptídeos adquiridos com um software de pesquisa proteômica usando um algoritmo de pesquisa comercial em um banco de dados uniProt humano.</li>
	<li>Defina a enzima de digestão para tripsina e permita até duas clivagens perdidas.</li>
	<li>Defina a tolerância do precursor como 10 ppm e a janela de tolerância do fragmento como 0,02 Da.</li>
	<li>Defina a oxidação da metionina e a acetilação N-terminal como modificações variáveis e a cisteína carbamidometilação como modificação fixa.</li>
	<li>Filtre os peptídeos com base em um limite de taxa de descoberta falsa (FDR) de 1,0%, conforme calculado pelo algoritmo Percolator.</li>
	<li>Considere apenas os peptídeos atribuídos a um determinado grupo de proteínas e não detectados em nenhum outro grupo de proteínas como únicos e use-os para análises adicionais.</li>
	<li>Incluir apenas um mínimo de dois peptídeos únicos para cada proteína nas análises.</li>
	<li>Maximize os IDs com a detecção de íons precursores.</li>
	<li>Realize o alinhamento cromatográfico com uma mudança máxima de tempo de retenção de 10 min, tolerância de massa de 10 ppm e mínimo de 5 relação sinal-ruído.</li>
	<li>Normalize a abundância de peptídeos pela quantidade total de peptídeos.</li>
</ol>

Reciclagem eficiente de tubos de ultracentrífuga de policarbonato para proteômica

<ol>
	<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, e854347 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).</li><li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins.">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li><li>Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+identifies+proteins+enriched+in+large+and+small+extracellular+vesicles.">Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 21 (9), 100273 (2022).</li><li>van Herwijnen, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+human+milk-derived+extracellular+vesicles+unveils+a+novel+functional+proteome+distinct+from+other+milk+components.">Comprehensive proteomic analysis of human milk-derived extracellular vesicles unveils a novel functional proteome distinct from other milk components.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (11), 3412-3423 (2016).</li><li>Blaser, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+of+tissue+extracellular+vesicles+identifies+unique+modulators+of+atherosclerosis+and+calcific+aortic+valve+stenosis.">Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis.</a> Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).</li><li>Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+cationic+peptides+to+solid+surfaces+of+glass+and+plastic.">Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic.</a> PLOS ONE. 10 (5), e0122419 (2015).</li><li>Use and care of centrifuge tubes and bottles. Beckman Coulter Available from: <a target="_blank" href="https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles">https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles</a> (2014)</li><li>Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+quantifying+polycarbonate+and+polyethylene+terephthalate+microplastics+in+environmental+samples+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).</li><li>Schittek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermcidin:+a+novel+human+antibiotic+peptide+secreted+by+sweat+glands.">Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).</li><li>Blaydon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+CSTA,+encoding+Cystatin+A,+underlie+exfoliative+ichthyosis+and+reveal+a+role+for+this+protease+inhibitor+in+cell-cell+adhesion.">Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).</li><li>Henry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hornerin+is+a+component+of+the+epidermal+cornified+cell+envelopes.">Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes.</a> FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).</li><li>Bolling, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+ichthyotic+peeling+skin+syndrome+due+to+FLG2+mutations.">Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).</li><li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMP+molecules+S100A9+and+S100A8+activated+by+IL-17A+and+house-dust+mites+are+increased+in+atopic+dermatitis.">DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis.</a> Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).</li><li>Gl&#228;ser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+protein+psoriasin+(S100A7)+is+upregulated+in+atopic+dermatitis+and+after+experimental+skin+barrier+disruption.">The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).</li><li>Molhave, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=House+dust+in+seven+Danish+offices.">House dust in seven Danish offices.</a> Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).</li><li>Buschow, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-associated+proteins+in+B-cell+exosomes+and+potential+functional+implications+for+exosome+biogenesis.">MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Aqui descrevemos e validamos um protocolo para limpeza de tubos de policarbonato UC para enriquecimento EV e aplicações proteômicas. Demonstramos a remoção bem-sucedida da proteína residual da amostra anterior do tubo UC em comparação com uma análise de pseudo-pellet limpo abaixo do limite de detecção deste protocolo de aquisição de espectrometria de massa e mostramos a semelhança proteômica do tubo UC nunca usado em branco em comparação com os pseudo pellets de tubo UC limpos.
<p class="jove_content...

As vesículas extracelulares (EVs) são partículas delimitadas por bicamadas lipídicas liberadas de células que carregam cargas biologicamente ativas, como proteínas, e participam de vários processos biológicos, incluindo a comunicação célula-célula e a formação de mineralização biológica1. Essas partículas são encontradas em todos os fluidos e tecidos corporais, e suas atividades e usos biológicos são um campo de pesquisa científica em rápida evolução. O isolamento e a validação dessas nanopartículas apresentam vários desafios devido ao seu pequeno tamanho e biossimilaridade com outras partículas, como lipossomas e agregados proteicos. As diretrizes mais recentes da Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares, Informações mínimas para estudos de vesículas extracelulares 2018 (MISEV2018), são o padrão reconhecido para pesquisa científica EV2.
Vários métodos, geralmente em conjunto, devem ser usados para isolamento de EV, dependendo da fonte upstream e das aplicações downstream. A partir de 2015, o método de isolamento primário mais comum para EVs foi a ultracentrifugação diferencial (UC)2. Em princípio, a centrifugação inicial de baixa velocidade separa componentes indesejados maiores ou mais densos, como células e detritos celulares, deixando EVs no sobrenadante. Posteriormente, a UC usa uma força centrífuga muito alta para expulsar e, assim, separar e purificar EVs de outras partículas menores ou menos densas, mas que também podem conter partículas densas não EV. A maioria dos protocolos costuma usar, em uma etapa ou outra, UC para isolar EVs de um fluido3. Além disso, o UC é usado em outros métodos de isolamento de EV, como a ultracentrifugação de gradiente de densidade (DGUC), que usa meios como OptiprepTM iodixanol e força centrífuga para separar EVs de acordo com sua densidade flutuante4. Existem outros métodos de isolamento EV3.
Considerando a compreensão em rápida evolução dos processos biológicos ditados pelas EVs e seu potencial como biomarcadores e informações sobre fisiopatologia, análises baseadas em descobertas, como proteômica, ganharam força 5,6,7,8. Os EVs são pequenos e, dependendo da fonte, têm baixo rendimento de proteína (<1 μg) quando comparados ao tecido total ou lisado celular. O isolamento de EVs para análise proteômica requer considerações especiais, como a remoção de contaminantes de proteínas não EV de líquidos ou tecidos a montante, a consideração da degradação da proteína EV durante o processo de isolamento e a utilização de métodos que criam soluções proteicas quimicamente compatíveis com a preparação de peptídeos e análises de espectrometria de massa.
Os consumíveis de laboratório de pesquisa geralmente são de plástico e descartáveis por natureza. Esses materiais de uso único contribuem para a crise global de poluição plástica e custos de consumíveis. Os tubos UC especializados de policarbonato e poliestireno são projetados para suportar as altas forças centrífugas necessárias para pellets EVs em aplicações de laboratório. Embora seja possível esterilizar e desinfetar tubos de UC para reutilização, a análise proteômica, especialmente aquelas de baixo rendimento de proteína, como EVs, requer atenção especial. Não apenas a remoção suficiente de proteína residual do uso anterior é fundamental, mas também deve ser considerada a compatibilidade química com espectroscopia de massa e contaminação por polímeros derivados de plástico.
Aqui apresentamos um protocolo de limpeza de tubos de policarbonato usando detergentes adequados para espectrometria de massas e realizamos experimentos para validar sua remoção bem-sucedida de proteína residual abaixo dos limites de detecção e falta de contaminantes poliméricos detectáveis. Para validar o protocolo de limpeza para aplicações proteômicas de EV usando os propósitos de UC e DGUC, obtivemos tubos de isolamentos de EVs de tecido de vasculatura humana com um protocolo combinado de UC e DGUC. Os tubos foram limpos usando o protocolo descrito, e o processo experimental foi repetido sem amostras comparando um tubo UC nunca usado em branco e um tubo UC limpo. Em última análise, a validação de um protocolo de limpeza de tubos UC adequado para o enriquecimento de EVs reduzirá os resíduos produzidos pelos laboratórios de EV e diminuirá o custo associado a tais experimentos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355630</td>
			<td>uncapped ultracentrifuge tube(s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355603</td>
			<td>capped ultracentrifuge tube(s)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 &#181;m x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 &#181;m x 250 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>164946 and ES902</td>
			<td>Dual column setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Swab Swab, Cotton Head</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89031-270</td>
			<td>cotton swab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. &#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BRE725533</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Human database</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreOmics iST kit &#160;</td>
			<td>PreOmics</td>
			<td>P.O.00027</td>
			<td>commercial protein sample preparation kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer &#160;package (PD, Version 2.5)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td>Proteomic search software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEQUEST-HT search algorithm&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Search algorithm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (20%)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BM-230</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polycarbonate ultracentrifuge tube re-use in proteomic analyses of extracellular vesicles

Os plásticos de laboratório de uso único exacerbam a crise de poluição e contribuem para os custos de consumíveis. No isolamento de vesículas extracelulares (EV), tubos de ultracentrífuga (UC) de policarbonato são usados para suportar as altas forças centrífugas associadas. A proteômica EV é um campo avançado e faltam protocolos de reutilização validados para esses tubos. A reutilização de consumíveis para protocolos de isolamento de proteínas de baixo rendimento e proteômica downstream requer compatibilidade de reagentes com aquisições de espectroscopia de massa, como a ausência de contaminação de polímeros sintéticos derivados de tubos de centrífuga e remoção suficiente de proteínas residuais.
Este protocolo descreve e valida um método para limpeza de tubos de policarbonato UC para reutilização em experimentos de proteômica EV. O processo de limpeza envolve a submersão imediata dos tubos UC em H2O para evitar a secagem da proteína, lavagem em detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1%, enxágue em água quente da torneira, água desmineralizada e etanol 70%. Para validar o protocolo de reutilização do tubo UC para proteômica EV a jusante, os tubos usados foram obtidos após um experimento isolando EVs do tecido cardiovascular usando UC diferencial e separação de gradiente de densidade. Os tubos foram limpos e o processo experimental foi repetido sem amostras de EV, comparando tubos UC nunca usados em branco com tubos UC limpos. Os pellets pseudo-EV obtidos dos procedimentos de isolamento foram lisados e preparados para cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem usando um kit comercial de preparação de amostras de proteínas com modificações para amostras de proteínas de baixa abundância.
Após a limpeza, o número de proteínas identificadas foi reduzido em 98% no pseudo-pellet em comparação com a amostra de isolamento EV anterior do mesmo tubo. Comparando um tubo limpo com um tubo em branco, ambas as amostras continham um número muito pequeno de proteínas (≤20) com 86% de similaridade. A ausência de picos de polímero nos cromatogramas dos tubos limpos foi confirmada. Em última análise, a validação de um protocolo de limpeza de tubos UC adequado para o enriquecimento de EVs reduzirá os resíduos produzidos pelos laboratórios de EV e diminuirá os custos experimentais.

Extracellular vesicles (EVs) are lipid-bilayer-delimited particles released from cells that carry biologically active cargo, such as protein, and participate in various biological processes, including cell-cell communication and the formation of biologic mineralization1. These particles are found in all body fluids and tissues, and their biological activities and uses are a rapidly evolving field of scientific research. Isolation and validation of these nanoparticles present various challenges due to their small size and bio-similarity to other particles, such as liposomes and protein aggregates. The most recent International Society of Extracellular Vesicles guidelines, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), are the recognized standard for EV scientific research2.
Various methods, often in tandem, must be used for EV isolation depending on the upstream source and the downstream applications. As of 2015, the most common primary isolation method for EVs was differential ultracentrifugation (UC)2. In principle, initial lower speed centrifugation separates&#160;larger or denser unwanted components, such as cells and cell debris, leaving EVs in the supernatant. Subsequently, UC uses very high centrifugal force to pellet out and thus separate and purify EVs from other particles that are smaller or less dense but which may also contain dense non-EV particles. Most protocols will often use, at one step or another, UC to isolate EVs from a fluid3. Further, UC is used in other methods of EV isolation, such as density gradient ultracentrifugation (DGUC), which uses mediums such as OptiprepTM iodixanol and centrifugal force to separate EVs according to their buoyant density4. Other methods of EV isolation exist3.
Considering the rapidly evolving understanding of the biological processes dictated by EVs and their potential as biomarkers and information regarding pathophysiology, discovery-based analyses such as proteomics have gained traction5,6,7,8. EVs are small, and, depending on the source, have a low yield of protein (&#60;1 &#956;g) when compared to whole tissue or cell lysate. Isolation of EVs for proteomics analysis requires special considerations, such as the removal of non-EV protein contaminants from upstream liquid or tissue, consideration of EV protein degradation during the isolation process, and the utilization of methods that create protein solutions that are chemically compatible with peptide preparation and mass spectrometry analyses.
Research laboratory consumables are often plastic and disposable in nature. These single-use materials contribute to the global plastic pollution crisis and consumable costs. Specialized polycarbonate and polystyrene UC tubes are designed to withstand the high centrifugal forces required to pellet EVs in laboratory applications. While it is possible to sterilize and disinfect UC tubes for re-use, proteomic analysis, especially those of low protein yields such as EVs, requires special attention. Not only is sufficient removal of residual protein from the previous use paramount, chemical compatibility with mass-spectroscopy and plastic-derived polymer contamination must also be considered.
Here we present a cleaning protocol of polycarbonate tubes using detergents suitable for mass-spectrometry and perform experiments to validate its successful removal of residual protein below limits of detection and lack of detectable polymer contaminants. To validate the cleaning protocol for EV proteomic applications using both UC and DGUC purposes, we obtained tubes from isolations of human vasculature tissue EVs with a combined UC and DGUC protocol. Tubes were cleaned using the protocol described, and the experimental process was repeated without samples comparing a blank never-used UC tube and a cleaned UC tube. Ultimately, the validation of a UC tube cleaning protocol suitable for the enrichment of EVs will reduce the waste produced by EV laboratories and lower the cost associated with such experiments.

Autor em destaque: Reutilização eficaz de tubos de policarbonato para isolamento de vesículas extracelulares

Reutilização de Tubo de Ultracentrífuga de Policarbonato em Análises Proteômicas de Vesículas Extracelulares

We study cardiovascular diseases, specifically the role of extracellular vesicles in the pathological calcification of cardiovascular tissues, such as valves and blood vessels. Researchers in our group have recently defined methods to extract tissue and trapped extracellular vesicles from fibro calcific cardiovascular tissue to determine their proteomic profile. Our group has demonstrated that these extracellular vesicles contain important protein cargo for initiating calcification in disease tissues.The specialized tubes used in the ultracentrifugation step of extracellular vesicle isolation can be cleaned and sterilized for reuse. However, proteomic analysis requires special consideration as any contamination could greatly affect downstream results. Here we validate a protocol for reusing consumables, specifically polycarbonate ultracentrifuge tubes for extracellular vesicle isolation that is suitable for downstream low input proteomics applications.Our protocol is simple and effective, and it will allow researchers to reduce both the consumable costs and the waste typically associated with these isolation protocols.

Para validar o protocolo de limpeza (Figura 1), foram realizados dois experimentos. Primeiro, o proteoma da "amostra simulada" do tubo limpo foi comparado com o proteoma da amostra EV do tecido do uso inicial do tubo para determinar o transporte de proteínas identificadas. Os cromatogramas representativos mostram uma redução no pico de heterogeneidade após a limpeza dos tubos (Figura 2). No isolamento EV original, 806 proteínas foram identificadas com dois ...

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Um protocolo detalhado é fornecido para limpeza e reutilização de tubos de ultracentrífuga de policarbonato para realizar o isolamento de vesículas extracelulares adequado para experimentos proteômicos.

Single-use laboratory plastics exacerbate the pollution crisis and contribute to consumable costs. In extracellular vesicle (EV) isolation, polycarbonate ...

Estudamos doenças cardiovasculares, especificamente o papel das vesículas extracelulares na calcificação patológica dos tecidos cardiovasculares, como válvulas e vasos sanguíneos. Pesquisadores do nosso grupo definiram recentemente métodos para extrair tecido e vesículas extracelulares aprisionadas do tecido cardiovascular fibrocalcificado para determinar seu perfil proteômico. Nosso grupo demonstrou que essas vesículas extracelulares contêm importante carga proteica para iniciar a calcificação em tecidos patológicos.Os tubos especializados usados na etapa de ultracentrifugação do isolamento de vesículas extracelulares podem ser limpos e esterilizados para reutilização. No entanto, a análise proteômica requer consideração especial, pois qualquer contaminação pode afetar muito os resultados a jusante. Aqui, validamos um protocolo para reutilização de consumíveis, especificamente tubos de ultracentrífuga de policarbonato para isolamento de vesículas extracelulares que são adequados para aplicações proteômicas de baixa entrada a jusante.Nosso protocolo é simples e eficaz e permitirá que os pesquisadores reduzam os custos de consumíveis e o desperdício normalmente associado a esses protocolos de isolamento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles

668 visualizações.  Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School. Estudamos doenças cardiovasculares, especificamente o papel das vesículas extracelulares na calcificação patológica dos tecidos cardiovasculares, como válvulas e vasos sanguíneos. Pesquisadores do nosso grupo definiram recentemente métodos para extrair tecido e vesículas extracelulares aprisionadas do tecido cardiovascular fibrocalcificado para determinar seu perfil proteômico. Nosso grupo demonstrou que essas vesículas extracelulares contêm importante carga proteica para iniciar ...