我们感谢 Fox Chase 癌症中心的基因组学核心以及 Johnathan Whetstine 博士实验室成员 Zach Gray、Madison Honer 和 Benjamin Ferman 为测序实验提供的技术支持。我们感谢 Estaras 博士和 Alex Morris 的实验室成员，他们是一名轮换研究生，为单细胞研究的初步分析做出了贡献。这项工作由 NIH 赠款 R01HD106969 和 R56HL163146 Conchi Estaras 资助。此外，Elizabeth Abraham 还获得了 T32 培训补助金 5T32HL091804-12 的支持。

该协议和所描述的所有动物实验均已正式批准，并符合天普大学机构动物护理和使用委员会制定的机构指南，该委员会遵循实验动物护理评估和认证协会国际指南。所有描述的小鼠均在 C57/BL6N 背景菌株上。在这些研究中未观察到动物健康问题。
1. 繁殖群和定时怀孕
<ol><li>通过阴道栓的可视化来安排怀孕时间。插头当天的中午被认为是 E0.5。</li>
	<li>笼子里的家鼠，床上用品材料含有碎裂的硬木床上用品和纸巢材料。<ol><li>每个笼子都包含老鼠食物、淡水和富集物品（例如，隧道和筑巢材料）。在定时繁殖期间每天跟踪和收集蜂群信息。</li>
		<li>记录所有信息，例如小鼠的年龄、雌性小鼠的怀孕次数、雄性小鼠放置的插头数量以及雌性小鼠的发情阶段（图 2）。 注意：已经生育 1-2 次的雌性将在未来的怀孕中产下更大的窝产仔数。</li>
	</ol></li>
	<li>在开始定时怀孕之前，在繁殖前 1 周将雄性小鼠单独关在笼子里。在繁殖开始的一周内，在笼子里为每只雄性引入至少 1 只雌性。 注意：根据批准的动物方案，可能允许在繁殖笼中添加 2-3 只雌性，并且最好增加栓子的产生。</li>
	<li>设置至少 4 个繁殖三人组（2 只雌性小鼠对 1 只雄性），以增加跨笼同步怀孕的机会（即同一天多个插头）。这将增加在同一发育阶段分离的胚胎数量。</li>
	<li>在下午 5 点之前或晚上安排理想的交配，雌性被放入雄性的笼子里，反之亦然。如果 4-5 天内没有繁殖，请考虑每隔一天更换一次交配伙伴。 注意：如果第二天早上无法检查阴道塞，请在前一天晚上（即周末/节假日）将繁殖对分开。</li>
	<li>每天清晨检查阴道塞;最好在上午 9 点之前。<ol><li>要检查阴道塞，轻轻地抬起雌性小鼠的尾巴根部并观察阴道口。寻找白色或奶油色的凝胶状物质。通常，阴道塞可能很明显，但如果不清楚，请拿镊子轻轻探查阴道口。仅考虑更明显的隔离插头。请参阅 图 2C。 注意：早上尽早检查阴道塞至关重要，以免错过潜在的怀孕。栓子可以在 12 小时后脱落或溶解。 注意： 即使观察到插头，也不能保证雌性鼠标会怀孕。如果观察到部分或没有栓子，但雌性小鼠的阴道口附近发红，请不要考虑将这些雌性小鼠隔离，因为栓子粘住的可能性较小。交配后怀孕的可能性因小鼠品系而异，取决于交配期间发情周期的阶段（图 2）。</li>
	</ol></li>
	<li>观察到阴道栓后，记录当天的情况。观察到阴道栓的当天中午被认为是 E0.5。将雌性小鼠与繁殖笼分开，并根据所需的原肠胚形成阶段分离胚胎。 注意： 此方法不提供精确的配接时间。传统上，假设交配发生在前一天晚上的午夜左右。因此，到观察到阴道栓塞当天的中午，胚胎被认为已经半天大 （E0.5）。</li>
</ol>2. 原肠胚形成过程中小鼠胚胎的分离
<ol><li>在开始胚胎分离之前，请准备所有必需的试剂和设备。<ol><li>用 70% 乙醇彻底清洁该区域。确保所有解剖工具（镊子和剪刀）都经过清洗和消毒。获得无菌的 5 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）/10% 胎牛血清 （FBS） 和 20 mL DPBS-/- 并置于冰上。</li>
		<li>使用带有透射光载物台和相机的立体显微镜进行所有分离，以协助进行大体发育表型分析。</li>
	</ol></li>
	<li>对怀孕的小鼠dam实施安乐死，并立即开始分离。<ol><li>将妊娠坝放入 CO2 室中，调整 CO2 流速，每分钟置换笼体体积的 20%。密切监测鼠标并通过观察没有呼吸运动来确认死亡。</li>
		<li>在没有呼吸运动后，再保持 CO2 流量 2 分钟。通过实施颈椎脱位来确认安乐死。</li>
		<li>将鼠标以正常的站立姿势放置在坚固、平坦的表面上。然后，用一只手的拇指和食指抵住颅底的脖子后部，向前和向下推，同时用另一只手握住尾部底部向后拉。</li>
		<li>通过感觉颈椎分离来验证脱位的有效性。当脊髓被切断时，在枕骨髁和第一颈椎之间可以触及 2-4 毫米的空间。 注意：不要一次对多个怀孕的母细胞实施安乐死，因为细胞活力会受到影响。如果得到机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 或同等机构的批准，异氟烷可用作替代麻醉剂。</li>
	</ol></li>
	<li>将怀孕的筒仰卧，并用乙醇对阴道口附近的区域进行消毒。<ol><li>使用解剖剪刀和镊子，提起阴道口附近的皮肤褶皱，做一个小的 V 形切口，慢慢露出怀孕母犬的子宫（图 3 [黄色箭头]）。</li>
		<li>用镊子握住怀孕母犬的一端并沿着它切割，切开子宫角，确保去除子宫颈。将子宫角放入含有 DPBS - / - 的 10 厘米培养皿中（图 3）。 注意：根据胚胎分离阶段，子宫将类似于较小或较大的植入部位（即绳子上的“珍珠”）。</li>
	</ol></li>
	<li>用解剖剪刀和镊子，切下每个包含蜕膜肿胀的植入部位（“珍珠”），并放入新鲜的 DPBS - / - 在冰上的 6 厘米培养皿中（图 3）。 注意：一个怀孕的母马平均会有大约 6-8 个植入的胚胎。</li>
	<li>取一个植入部位，将其放在立体显微镜载物台顶部的新 6 cm 培养皿上，并在其顶部添加 500 μL 的 DPBS - / - 。调整显微镜和光源的焦距（图 3）。 注意：根据植入部位的大小，DPBS 的量可能会有所不同;目标是有足够的 DPBS 来淹没着床部位。</li>
	<li>使用细尖解剖镊子，从植入部位去除子宫肌肉。一只手用一组镊子按住着床部位，另一只手慢慢地将另一对镊子插入从子宫角切下的着床部位的末端，慢慢露出蜕膜肿胀（图3）。 注意：不要用力拉扯子宫表面，因为这会导致蜕膜肿胀破裂甚至胚胎裂解。</li>
	<li>分离出蜕膜肿胀后，继续露出胚胎。<ol><li>用一对镊子握住蜕膜肿胀的抗蜕膜端，然后用另一对镊子从蜕膜肿胀端缓慢地进行约 1/4 大小的水平切口（即，通常是蜕膜肿胀的更尖锐的一端）。</li>
		<li>现在，用两个镊子，从蜕膜肿胀的抗中膜端慢慢推出，胚胎将从新鲜切割的中膜端弹出（图 3）。 注意：不要撕裂蜕膜肿胀，因为这会破坏胚胎。如有必要，沿着蜕膜肿胀的中端做较小的切口。</li>
	</ol></li>
	<li>一旦胚胎显露出来，就去除任何附着的胚外组织。<ol><li>在揭示过程中，顶层内胚囊和外胎盘锥可能会自发地从胚胎中脱落，但如果没有，请使用一对镊子将它们与任何相关的母体血液一起取出。然后，使用两把镊子，用一对钳子压住胚胎，用另一对钳子慢慢地从胚胎上剥下内脏卵黄囊。</li>
		<li>使用 P20 移液器，将培养皿中含有不超过 10 μL DPBS - /- 的卵黄囊放入冰上的 8 联管聚合酶链反应 （PCR） 中，因为这将用于当天进行基因分型。 注：卵黄囊样品不被妊娠母细胞的组织污染至关重要。污染可能导致胚胎的基因型分配不正确。</li>
	</ol></li>
	<li>拍摄新鲜分离的胚胎的明场照片，以确保同窝胚胎的分期相似。使用 P200 移液器，用 50 μL DMEM/10% FBS 缓慢吸取胚胎，并将其放入冰上的 1.5 mL 试管中。让胚胎保持在冰上，直到确认基因型。 注意：将胚胎在冰上保持 3-4 小时，没有明显的降解，但不要超过这个时间，因为细胞活力会降低。相应地标记胚胎和基因分型管。鼓励拍摄明场图像以识别和注释胚胎之间的粗略表型差异。</li>
	<li>对所有剩余的蜕膜肿胀重复这些步骤。清洁所有解剖工具，并在每次分离时使用新的塑料制品，以确保没有来自先前分离的污染。 注意：确保解剖程序仅限于从妊娠母犬收集植入部位的那一刻起 1 小时。</li>
	<li>在进行当天基因分型步骤之前，继续从下一个怀孕的母马中分离胚胎（如果确定了多个同步妊娠）。</li>
</ol>3. 当天基因分型（图 4）
<ol><li>在 8 联排 PCR 管中消化每个内脏卵黄囊。使用 P20 移液器，向每个卵黄囊样品中加入 19.3 μL PCR 模板 DNA 裂解缓冲液和 0.7 μL 0.2 μg/mL 蛋白酶 K。</li>
	<li>使用带有条带适配器的微型离心机以 1,000 x g 的速度涡旋样品 10 秒，然后向下旋转以将样品定位在试管底部 10 秒。将 8 条 PCR 管置于 85 °C 加热块中 45 分钟，每 5 分钟涡旋 5 秒。 注：重要的是在消化时涡旋样品，以在 45 分钟内最大限度地提高细胞裂解率。</li>
	<li>45 分钟后，使用带有条带适配器的微型离心机以 1,000 x g 的速度旋转试管条 10 秒，然后进行 PCR 以获得所需的基因鉴定。作为参考，提供了 Cre-lox 系统的示例协议。以下是 Cre 基因分型的 PCR 条件示例。设计引物以扩增目标 Cre 位点的 5' 和 3' 区域。</li>
	<li>为了进行 Cre 基因分型的 PCR 反应，为每个卵黄囊的每个 8 条式 PCR 管制备 PCR 预混液，其中含有 10 μL Taq DNA 聚合酶混合物、0.5 μL 0.5 μM 正向 Cre 引物、0.5 μL 0.5 μM 反向 Cre 引物、5 μL PCR 认证水和 4 μL 卵黄囊基因组 DNA。 注：如果使用针对小鼠尾部基因分型优化的方案，则添加两倍的 DNA 量，通常用于获得更清晰的结果。</li>
	<li>制备 PCR 预混液后，运行 PCR 热循环扩增程序。对于 Cre 基因分型，循环如下：（1） 95 °C 3 分钟，（2） 95 °C 30 秒，（3） 55 °C 30 秒，（4） 72 °C 30 秒，重复步骤 2-4 34 个循环，（5） 72 °C 10 分钟，（6） 4 °C 保持。在 1% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产物以得出基因分型结论。 注：如果基因鉴定需要多个 PCR，请同时运行 PCR 反应以优化时间。为了加快该过程，请在实验当天提前一天准备琼脂糖凝胶，并将其在 4 °C 下储存过夜。不要考虑任何没有明确基因型的样品。同时考虑样本的基因型和发育阶段，因为同窝仔可能处于原肠胚形成的不同阶段，并可能导致结果偏斜。当对 LoxP 等位基因进行基因分型时，凝胶中预期的 PCR 条带可能会因所使用的 Cre 驱动因子而异。例如，如果 Cre 驱动因子在内脏卵黄囊中表达，则与 Cre 阴性 （Cre-） 相比，Loxp 带在 Cre 阳性 （Cre+） 胚胎中会出现偏移。然而，如果 Cre 不在内脏卵黄囊中表达，则 Loxp 带的大小在 Cre+ 和 Cre- 胚胎中的大小将相同（即，Loxp 等位基因不会在卵黄囊谱系中絮凝）。携带一个 Cre+ 等位基因和两个 Loxp 等位基因的胚胎被认为是条件性 KO 胚胎。然而，为了确认 floxed 基因的缺失，建议通过重复基因分型方案或通过 qPCR 分析floxed 基因的 mRNA 水平，在表达 Cre 驱动的细胞上确认基因敲除（图 4D，E）。</li>
	<li>将剩余的消化卵黄囊样品储存在 -20 °C 冰箱中长期储存。</li>
</ol>4. 胚胎的细胞解离和细胞活力
<ol><li>一旦确认了基因型，取 P200 移液器并移液 50 μL DMEM/10% FBS。将具有相同基因型的胚胎汇集到新的 1.5 mL 试管中，并将试管置于冰上。 注意：如果每组 （E7-E7.5） 或 3 个 （E7.75-E8） 没有至少 5 个胚胎，请不要进行实验，因为细胞数量和活力会大大减少。</li>
	<li>根据基因型合并胚胎后，让它们沉降到试管底部。通过添加 50 μL DPBS - / - 洗涤合并的胚胎，然后等待胚胎沉淀，然后再尽可能多地去除 DPBS - / - 而不从管中取出胚胎。重复此步骤两次。 注：将 1.5 mL 试管靠近光源或朝向窗口，将更容易看到胚胎沉降到试管底部。</li>
	<li>向合并的胚胎中加入 100 μL 胰蛋白酶，并在 37 °C 下在加热块中孵育 5 分钟。每 30 秒轻轻轻弹 1.5 mL 试管，以帮助细胞解离。 注：在胰蛋白酶消化过程中请勿使用涡旋或移液器，因为它会损坏细胞。如果合并超过 5 个胚胎 （E7-E7.5） 或 3 个胚胎 （E7.75-E8），则在另一支含有等量胰蛋白酶（每 1 个胚胎 ~20 μL）的试管中进行胰蛋白酶消化。每个胚胎使用 ~20 μL 胰蛋白酶 （E6.5-E7.5），每个胚胎 35 μL （E7.75），胚胎 40 μL （E8）。</li>
	<li>5 分钟后，用 300 μL DMEM/10% FBS 中和胰蛋白酶。在室温 （RT） 下以 100 x g 离心合并的胚胎 4 分钟。离心后，所有样品都会出现一个小沉淀。将沉淀重悬于 40 μL DMEM/10% FBS 中，并将它们置于冰上。 注意：颗粒的大小将根据合并的胚胎数量而变化。颗粒可能不可见，但请继续执行下一步。中和胰蛋白酶所需的 DMEM/10% FBS 量取决于添加的胰蛋白酶量。向胰蛋白酶量中加入 3 倍量的 DMEM/10%。</li>
	<li>使用自动细胞计数器测定重悬细胞 （40 μL） 的浓度。在新的 1.5 mL 试管中将 5 μL 细胞与 5 μL 台盼蓝混合。移液管充分混合，然后移液到载玻片上以确定细胞数量和细胞活力。最佳细胞浓度为 700-1200 个细胞/μL，细胞活力为 90% 或更高。 注：如果浓度低于 200 个细胞/μL 且活力低于 50%，请勿继续实验。如果细胞浓度过高，请稀释细胞悬液并再次重新计数细胞。如果观察到细胞团块，请使用细胞过滤器确保单细胞悬液。</li>
	<li>使用微流控芯片进行单细胞分配，并遵循微流控芯片制造商的协议11。</li>
</ol>5. 细胞核分离小鼠胚胎（从 E8 开始的较大胚胎时间点的选项）
<ol><li>制备 表 1 中概述的新鲜裂解和洗涤缓冲液，并将它们放在冰上。 注：可以在新鲜或冷冻样品上进行细胞核分离。如果样品被冷冻，请让它们在冰上解冻 2-5 分钟。</li>
	<li>在开始实验之前，确认所有基因型并仅合并具有明确基因型的胚胎。</li>
	<li>使用 P200 移液器，将 50 μL 细胞核裂解缓冲液添加到 1.5 mL 试管中的合并胚胎中，目标是每个突变组至少 3 个胚胎。让样品在装有裂解缓冲液的冰上静置 5 分钟，每 30 秒涡旋一次。</li>
	<li>孵育 5 分钟后，在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。 使用 P200 移液器去除上清液，并将沉淀重悬于 50 μL 洗涤缓冲液中。重悬后，在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>去除上清液并重悬于 40 μL DPBS - / - 中。使用自动细胞计数器对细胞进行计数。在新的 1.5 mL 试管中混合 5 μL 细胞核和 5 μL 台盼蓝。彻底移液混合物并将其加载到载玻片上以确定细胞数量和活力。 注：核膜可渗透台盼蓝;因此，分离的细胞核染色对台盼蓝呈阳性。在自动细胞计数仪中，死细胞的百分比用于估计分离细胞核的百分比（图 5A）。</li>
	<li>如果完整细胞核的百分比大于 90%（意味着至少 90% 的细胞核被台盼蓝染色并表现出圆形和膨胀的外观;参见 图 5B、C），请继续使用微流体芯片并遵循微流体芯片制造商的协议11。</li>
</ol>6. 单细胞分区（包括 cDNA 扩增和文库构建）
<ol><li>按照微流控芯片制造商的方案11 立即进行单细胞 RNA 测序方案，以获得最佳结果。将目标细胞回收率设置为 6000 个细胞或更大。</li>
</ol>7. 排序
<ol><li>构建文库后，使用自动电泳分析仪测量样品的片段大小分布和浓度。 注：最佳片段大小分布在 300-1000 bp 之间。</li>
	<li>样本已准备好加载到定序器中。将来自不同样本的元器件库汇集在一起。混合文库的最终上样浓度为 750 pM，总体积为 24 μL。按照测序制造商的方案12，将混合文库加载到试剂盒中。</li>
	<li>根据所需的测序深度，通过双端双索引对加载到预组装流动槽和柱中的文库进行测序。遵循微流控芯片制造商概述的协议的测序读数如下11：读取 1：28 个周期，i7 指数：10 个周期，i5 指数：10 个周期，读取 2：90 个周期。测序完成后，数据进行生物信息学分析。</li>
	<li>使用生物信息学方法进行质量控制。这包括评估测序细胞的数量、每个细胞的读数以及每个细胞定位的基因数量。 注：为获得最佳结果，测序细胞的数量至少为目标细胞的 80%。建议每个细胞的读数数至少为 30,000 个，检测到的基因数高于 3000 个（对于小鼠样本）。</li>
</ol>

用于单细胞测序的原肠胚胚分离和基因分型

<ol>
	<li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastruloids:+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering.">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li><li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology:+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond.">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li><li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis.">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li><li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-embryo,+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation.">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), P2825-P2842 (2021).</li><li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+Coordination+of+tissue+patterning,+specification+and+diversification+of+cell+fate.">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617 (2020).</li><li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution.">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li><li>Chan, M. 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Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024)</li><li>Dai, H. 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作者没有什么可披露的。

本文提出了一种从原肠胚中获得高质量单细胞和细胞核悬浮液的稳健管道，专门用于促进早期发育中细胞命运规范机制的研究。该方法通过优化需要基因型（例如性别或体细胞基因）的胚胎的分析，解决了原肠胚形成领域的关键空白。通过利用基因突变小鼠模型并在全小鼠胚胎上采用高分辨率单细胞测序，该管道可以进一步增强对早期小鼠原肠菌基因表达谱的理解。该方法证明了通过 Cre 重组酶?...

胃肠胚形成是正常发育所需的基本过程。当多能细胞转变为定义器官形成方式的谱系特异性前体时，就会发生这种快速而动态的过程。多年来，原肠胚形成长期以来被定义为三个基本同质的群体的形成：中胚层、外胚层和内胚层。然而，高分辨率技术和大量新兴的胚胎干细胞模型 1,2 揭示了早期胚层之间前所未有的异质性 3,4。这表明关于调节原肠不同细胞群的机制还有更多有待揭示。小鼠胚胎发育一直是研究原肠胚形成过程中早期细胞命运决策的最佳模型之一 3,5。小鼠的原肠胚形成是迅速的，因为原肠胚形成的整个过程发生在 48 小时内，从胚胎第 E6.5 天到 E85。
单细胞技术的最新进展使野生型小鼠胚胎发育的详细图谱成为可能，提供了原肠胚形成过程中胚胎细胞和分子景观的全面概述 3,4,6,7,8。然而，在这些阶段对突变胚胎的分析不太常见，通常仅限于 FACS 分类的群体 9,10。稀缺的文献反映了与需要基因分型的原肠胚的操作和单细胞制备相关的技术挑战。由于其快速性质，捕捉原肠胚形成的动态过程可能会带来挑战，尤其是对于理解突变胚胎。怀孕的时间和同步是必不可少的，因为即使定时怀孕之间的微小差异也可能被误解为突变基因导致的发育表型。当突变基因影响原肠胚形成过程时，这一点变得尤为重要13,14。在这项研究中，建立了指南，通过阴道栓的可视化（即交配后女性阴道中形成的凝固质量）获得同步妊娠。此外，还设计了一种策略，可从 E6.5 到 E8 的突变体包织胚胎中获得稳健的单细胞数据。该策略旨在克服与每次怀孕具有所需基因型的胚胎数量少以及冻融胚胎或细胞引起的活力降低相关的限制。
本文描述了一种优化的方法，从通过阴道栓建立定时妊娠到单个细胞/细胞核的最终测序。该方法解释了如何增加同步妊娠的数量以获得更多具有所需基因型的胚胎，细胞/细胞核分离以提高细胞的活力，以及当天基因分型方案。本手稿还描述了不同原肠胚形成时间点胚胎分离的过程。该方法有助于增加用于测序的最终活胚胎细胞/细胞核的数量，确保高质量的测序数据。因此，这种方法将为需要基因分型的原肠胚的单细胞研究打开大门。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Reach Barrier Tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>23-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L Reach Barrier Tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Reach Barrier Tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, small</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>27-125U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Bioresearch Product</td>
			<td>20-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>31-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>33-759R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller</td>
			<td>10X</td>
			<td>PN-1000127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X</td>
			<td>PN-1000269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Couning Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR yolk sac</td>
			<td>Viagen</td>
			<td>201-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubecco&#39;s Modificiation of Eagle&#39;s Medium (DMEM, 1x)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>V1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000 Imaging System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Green Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20046811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq2000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nondiedt P40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free Water</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Tube 8x Strip (401428)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Tube Cap 8x Strip (401425)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>31-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA Quantification Assay Kits</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Flex 3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-141-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Pattern Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Station Loading tips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 4150</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2992AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-007-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain 0.4%</td>
			<td>Theromo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of mutant whole mouse embryos: from the epiblast to the end of gastrulation

在过去十年中，单细胞方法已成为研究样本中基因表达动力学、细胞异质性和细胞状态的金标准。在单细胞发展之前，在早期发育过程中捕捉动态细胞景观和快速细胞转变的可行性是有限的。在本文中，设计了一个强大的管道，用于对从胚胎第 E6.5 天到 E8 的小鼠胚胎进行单细胞和细胞核分析，对应于原肠胚形成的开始和完成。原肠胚形成是发育过程中的一个基本过程，它建立了三个生发层：中胚层、外胚层和内胚层，它们对器官发生至关重要。关于应用于野生型腹膜胚胎的单细胞组学的大量文献。然而，突变胚胎的单细胞分析仍然很少，并且通常仅限于 FACS 分选的群体。这部分是由于与基因分型需求、定时怀孕、每次怀孕具有所需基因型的胚胎数量以及这些阶段每个胚胎的细胞数量相关的技术限制。在这里，提出了一种旨在克服这些限制的方法。这种方法建立了育种和定时怀孕指南，以实现与所需基因型同步怀孕的更高机会。胚胎分离过程中的优化步骤与当天基因分型方案 （3 h） 相结合，允许在同一天进行基于微滴的单细胞检测，确保细胞的高活力和可靠的结果。该方法还包括从胚胎中最佳细胞核分离的指南。因此，这些方法增加了原肠胚形成阶段突变胚胎单细胞方法的可行性。我们预计这种方法将有助于分析突变如何塑造原肠胚的细胞景观。

Gastrulation is a fundamental process required for normal development. This rapid and dynamic process occurs when pluripotent cells transition into lineage-specific precursors that define how organs form. For years, gastrulation was long defined as the formation of three largely homogeneous populations: mesoderm, ectoderm, and endoderm. However, high-resolution technologies and an emerging number of embryonic stem cell models1,2 unveil unprecedented heterogeneity among the early germ layers3,4. This suggests that much more remains to be uncovered about the mechanisms regulating the distinct cell populations of the gastrula. Mouse embryonic development has been one of the best models to study early cell fate decisions during gastrulation3,5. Gastrulation in mice is rapid, as the entire process of gastrulation occurs within 48 h, from embryonic day E6.5 to E85.
Recent advancements in single-cell technologies have enabled detailed mapping of wild-type mouse embryonic development, providing a comprehensive overview of the cellular and molecular landscapes of embryos during gastrulation3,4,6,7,8. However, the analysis of mutant embryos at these stages is less common and often limited to FACS-sorted populations9,10. The scarce literature reflects the technical challenges associated with the manipulation and single-cell preparation of gastrulating embryos that require genotyping. Capturing the dynamic process of gastrulation can pose challenges due to its rapid nature, especially for understanding mutant embryos. The timing and synchronization of pregnancies are essential, as even slight differences between timed pregnancies can be misinterpreted as a developmental phenotype resulting from the mutant gene. This becomes particularly important when the mutant gene influences the process of gastrulation13,14. In this study, guidelines are established to obtain synchronized pregnancies through visualization of vaginal plugs (i.e., the mass of coagulated seminal fluid formed in the female&#39;s vagina after mating). Additionally, a strategy is designed to obtain robust single-cell data from mutant gastrulating embryos from E6.5 to E8. This strategy is devised to overcome constraints associated with the low number of embryos with the desired genotype per pregnancy and the decrease in viability caused by freezing-thawing embryos or cells.
This paper describes an optimized methodology from the establishment of timed pregnancies via vaginal plugs to the final sequencing of single cells/nuclei. This method explains how to increase the number of synchronized pregnancies to obtain a higher number of embryos with desired genotype, cell/nuclei isolations to improve the viability of the cells, and a same-day genotyping protocol. This manuscript also describes the process of embryo isolation at different gastrulation time points. The methodology helps to increase the number of final viable embryo cells/nuclei for sequencing, ensuring high-quality sequencing data. Therefore, this method will open the doors for single-cell studies of gastrulating embryos that require genotyping.

作者聚焦：以单细胞分辨率分析谱系特异性突变胚胎的管道

突变全小鼠胚胎的单细胞 RNA 测序：从上胚层到原肠胚形成结束

We focus on deciphering the mechanisms controlling early cell fate decisions during embryonic stem cell differentiation, both in vitro and in mouse models. Complex regulatory networks guide differentiation during development, and we investigate how the interplay of signaling pathways, transcription factors, and epigenetic regulators promote different cell fates. Studying the dynamic and rapid process of gastrulation in mice is technically challenging due to the small number of cells per embryo and the limited number of embryos with the desired genotype per litter.While literature extensively shows the study of single cells using wild type or fluorescent-activated cell sorted populations of embryos, a comprehensive analysis of embryos with lineage mutations is still limited. Our protocol offers the possibility of generating single-cell omic datasets from gastrulating embryos harboring lineage mutations. It will help scientists with none or limited mouse handling experience or who wanna learn early embryo manipulation or single-cell approaches.Our protocol will help answer new scientific questions in gastrulation and early organogenesis, including heart development. We provide a pipeline to analyze lineage-specific mutant embryos at single-cell resolution, which will facilitate analysis of the role of a specific genes in lineage commitment. We hope to use this methodology to understand the regulatory mechanisms of cell fate decisions during the rapid and dynamic process of gastrulation.

本文设计的方法专门用于增强 E6.5 至 E8 单细胞组学胚胎样品的制备。这个强大的管道包括五个主要步骤：同步定时怀孕、胚胎分离、当天基因分型、细胞解离和细胞活力评估（图 1A）。虽然提供的数据侧重于从 E7 到 E7.5 的时间点，但它可以应用于高达 E8 的胚胎（图 1B），程序变化很小（请参阅整个协议中的注释）。通过将两只雌性小鼠与一只雄性小?...

本文建立了用于单细胞和细胞核测序的高质量原肠胚单细胞和细胞核悬液的管道。

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

single-cell-rna-sequencing-mutant-whole-mouse-embryos-from-epiblast

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

422 次观看.  Temple University, Lewis Katz School of Medicine. 我们专注于破译胚胎干细胞分化过程中控制早期细胞命运决策的机制，无论是在体外还是在小鼠模型中。复杂的调控网络指导发育过程中的分化，我们研究了信号通路、转录因子和表观遗传调节因子的相互作用如何促进不同的细胞命运。研究小鼠原肠胚形成的动态和快速过程在技术上具有挑战性，因为每个胚胎的细胞数量较少，而且每窝具有所需基?...