염기서열 분석 실험에 대한 기술 지원을 아끼지 않은 Fox Chase Cancer Center의 유전체학 핵심과 Dr. Johnathan Whetstine의 실험실 구성원인 Zach Gray, Madison Honer, Benjamin Ferman에게 감사드립니다. 우리는 Estaras 박사와 단일 세포 연구의 초기 분석에 기여한 순환 대학원생인 Alex Morris의 실험실 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01HD106969 및 Conchi Estaras에 대한 R56HL163146 자금을 지원합니다. 또한 Elizabeth Abraham은 T32 교육 보조금 5T32HL091804-12의 지원을 받았습니다.

Single-Cell Sequencing을 위한 Gastrulating Mouse embryo의 분리 및 유전형 분석

<ol>
	<li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastruloids:+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering.">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li><li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology:+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond.">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li><li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis.">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li><li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-embryo,+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation.">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), P2825-P2842 (2021).</li><li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+Coordination+of+tissue+patterning,+specification+and+diversification+of+cell+fate.">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617 (2020).</li><li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution.">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li><li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis.">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li><li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation.">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li><li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq.">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li><li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling.">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li><li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2024)</li><li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024)</li><li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling.">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation.">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922 (2023).</li><li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube.">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li></ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

이 논문에서는 gastrulating mouse embryos에서 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 얻기 위한 강력한 파이프라인을 제시하며, 특히 초기 개발에서 cell-fate 사양 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 하도록 설계되었습니다. 이 방법은 성별 또는 체세포 유전자와 같은 유전자형이 필요한 배아의 분석을 최적화하여 위형성 분야의 중요한 격차를 해결합니다. 이 파이프라인은 유전적 돌연변이 마우스 모델을 ?...

위축은 정상적인 발달에 필요한 기본적인 과정입니다. 이 빠르고 역동적인 과정은 만능 세포가 장기가 형성되는 방식을 정의하는 계통 특이적 전구체로 전환될 때 발생합니다. 수년 동안 gastrulation은 오랫동안 중배엽, 외배엽 및 내배엽의 세 가지 크게 균질 한 집단의 형성으로 정의되었습니다. 그러나, 고해상도 기술과 새로운 배아 줄기 세포 모델(embryonic stem cell model)1,2은 초기 생식층(germ layers)3,4 사이에서 전례 없는 이질성(heterogeneity)을 밝혀내고 있다. 이것은 위스트룰라의 뚜렷한 세포 집단을 조절하는 메커니즘에 대해 밝혀져야 할 것이 훨씬 더 많다는 것을 시사합니다. 마우스 배아 발달은 gastrulation 3,5 동안 초기 세포 운명 결정을 연구하는 가장 좋은 모델 중 하나였습니다. 생쥐의 위축은 배아 E6.5일에서 E85까지 48시간 이내에 전체 위형성 과정이 발생하기 때문에 빠릅니다.
최근 단세포 기술의 발전으로 야생형 마우스 배아 발달에 대한 상세한 매핑이 가능해졌으며, 이는 위축작용 중 배아의 세포 및 분자 환경에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다 3,4,6,7,8. 그러나, 이 단계에서 돌연변이 배아에 대한 분석은 덜 일반적이며, 종종 FACS에 의해 분류된 집단에 국한된다 9,10. 희소한 문헌은 유전형 분석이 필요한 gastrulating embryos의 조작 및 단일 세포 준비와 관련된 기술적 문제를 반영합니다. 위축의 역동적인 과정을 포착하는 것은 특히 돌연변이 배아를 이해하는 데 있어 빠른 특성으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 임신 시기와 동기화는 매우 중요한데, 임신 시기가 정해진 임신 간의 조금만 차이 나도 돌연변이 유전자에서 비롯된 발달 표현형으로 잘못 해석될 수 있기 때문입니다. 이것은 돌연변이 유전자가 위형성 과정에 영향을 미칠 때 특히 중요해진다13,14. 이 연구에서는 질 마개(즉, 짝짓기 후 암컷의 질에서 형성된 응고된 정액의 질량)의 시각화를 통해 동기화된 임신을 얻기 위한 지침을 수립합니다. 또한, E6.5에서 E8까지의 돌연변이 배아로부터 강력한 단세포 데이터를 얻기 위한 전략이 고안되었습니다. 이 전략은 임신당 원하는 유전자형을 가진 배아의 수가 적고 배아 또는 세포의 동결-해동으로 인한 생존력 감소와 관련된 제약을 극복하기 위해 고안되었습니다.
이 논문은 질 플러그를 통한 시간 제한 임신의 확립부터 단일 세포/핵의 최종 시퀀싱에 이르기까지 최적화된 방법론을 설명합니다. 이 방법은 원하는 유전자형을 가진 더 많은 수의 배아를 얻기 위해 동기화된 임신 수를 늘리는 방법, 세포의 생존력을 개선하기 위한 세포/핵 분리 및 당일 유전형 분석 프로토콜을 설명하는 방법을 설명합니다. 이 원고는 또한 다양한 위축 시점에서의 배아 분리 과정을 설명합니다. 이 방법론은 염기서열분석을 위한 최종 생존 가능한 배아 세포/핵의 수를 증가시켜 고품질 염기서열분석 데이터를 보장하는 데 도움이 됩니다. 따라서 이 방법은 유전형 분석이 필요한 배아의 단세포 연구의 문을 열 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Reach Barrier Tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>23-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L Reach Barrier Tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Reach Barrier Tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;m Reversible Strainer, small</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>27-125U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Bioresearch Product</td>
			<td>20-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Dry Bath</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>31-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>33-759R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller</td>
			<td>10X</td>
			<td>PN-1000127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X</td>
			<td>PN-1000269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Couning Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectPCR yolk sac</td>
			<td>Viagen</td>
			<td>201-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubecco&#39;s Modificiation of Eagle&#39;s Medium (DMEM, 1x)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>V1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000 Imaging System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Green Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11049-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AC223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20046811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq2000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ 1000 Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nondiedt P40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free Water</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Tube 8x Strip (401428)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Tube Cap 8x Strip (401425)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon 31-511, HS24 Microcentrifuge, with 24 x 1.5/2.0 mL rotor, 1 Centrifuge/Unit</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>31-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA Quantification Assay Kits</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Flex 3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-141-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Pattern Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape Station Loading tips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapestation 4150</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2992AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-007-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain 0.4%</td>
			<td>Theromo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer IKA MS3 with 96-well sample plate adapter</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of mutant whole mouse embryos: from the epiblast to the end of gastrulation

지난 10년 동안 단일 세포 접근법은 유전자 발현 역학, 세포 이질성 및 샘플 내 세포 상태를 연구하기 위한 황금 표준이 되었습니다. 단일 세포가 발전하기 전에는 초기 개발 과정에서 역동적인 세포 환경과 빠른 세포 전이를 포착하는 것이 불가능했습니다. 이 논문에서는 배아 E6.5일부터 E8일까지의 마우스 배아에 대해 단세포 및 핵 분석을 수행하도록 견고한 파이프라인을 설계했으며, 이는 위축작용의 시작 및 완료에 해당합니다. 위축(Gastrulation)은 기관 형성에 필수적인 세 가지 생식층, 즉 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm), 내배엽(endoderm)을 형성하는 발달 과정의 기본 과정입니다. 야생형 주위 배아에 적용되는 single-cell omics에 대한 광범위한 문헌을 이용할 수 있습니다. 그러나 돌연변이 배아에 대한 단세포 분석은 여전히 부족하며 FACS로 분류된 집단에 국한되는 경우가 많습니다. 이는 부분적으로 유전형 분석, 임신 시기 제한, 임신당 원하는 유전자형을 가진 배아의 수, 이 단계에서 배아당 세포 수의 필요성과 관련된 기술적 제약 때문입니다. 여기에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 고안된 방법론을 제시합니다. 이 방법은 원하는 유전자형과 동기화된 임신 가능성을 높이기 위해 번식 및 시기별 임신 지침을 설정합니다. 당일 유전형 분석 프로토콜(3시간)과 결합된 배아 분리 과정의 최적화 단계를 통해 미세 방울 기반 단일 세포를 같은 날에 수행할 수 있어 세포의 높은 생존력과 강력한 결과를 보장할 수 있습니다. 이 방법에는 배아에서 최적의 핵 분리를 위한 지침이 추가로 포함됩니다. 따라서, 이러한 접근법은 위축(gastrulation) 단계에서 돌연변이 배아(mutant embryo)에 대한 단세포 접근법의 실현 가능성을 증가시킨다. 우리는 이 방법이 돌연변이가 위골의 세포 환경을 어떻게 형성하는지에 대한 분석을 용이하게 할 것으로 기대합니다.

Gastrulation is a fundamental process required for normal development. This rapid and dynamic process occurs when pluripotent cells transition into lineage-specific precursors that define how organs form. For years, gastrulation was long defined as the formation of three largely homogeneous populations: mesoderm, ectoderm, and endoderm. However, high-resolution technologies and an emerging number of embryonic stem cell models1,2 unveil unprecedented heterogeneity among the early germ layers3,4. This suggests that much more remains to be uncovered about the mechanisms regulating the distinct cell populations of the gastrula. Mouse embryonic development has been one of the best models to study early cell fate decisions during gastrulation3,5. Gastrulation in mice is rapid, as the entire process of gastrulation occurs within 48 h, from embryonic day E6.5 to E85.
Recent advancements in single-cell technologies have enabled detailed mapping of wild-type mouse embryonic development, providing a comprehensive overview of the cellular and molecular landscapes of embryos during gastrulation3,4,6,7,8. However, the analysis of mutant embryos at these stages is less common and often limited to FACS-sorted populations9,10. The scarce literature reflects the technical challenges associated with the manipulation and single-cell preparation of gastrulating embryos that require genotyping. Capturing the dynamic process of gastrulation can pose challenges due to its rapid nature, especially for understanding mutant embryos. The timing and synchronization of pregnancies are essential, as even slight differences between timed pregnancies can be misinterpreted as a developmental phenotype resulting from the mutant gene. This becomes particularly important when the mutant gene influences the process of gastrulation13,14. In this study, guidelines are established to obtain synchronized pregnancies through visualization of vaginal plugs (i.e., the mass of coagulated seminal fluid formed in the female&#39;s vagina after mating). Additionally, a strategy is designed to obtain robust single-cell data from mutant gastrulating embryos from E6.5 to E8. This strategy is devised to overcome constraints associated with the low number of embryos with the desired genotype per pregnancy and the decrease in viability caused by freezing-thawing embryos or cells.
This paper describes an optimized methodology from the establishment of timed pregnancies via vaginal plugs to the final sequencing of single cells/nuclei. This method explains how to increase the number of synchronized pregnancies to obtain a higher number of embryos with desired genotype, cell/nuclei isolations to improve the viability of the cells, and a same-day genotyping protocol. This manuscript also describes the process of embryo isolation at different gastrulation time points. The methodology helps to increase the number of final viable embryo cells/nuclei for sequencing, ensuring high-quality sequencing data. Therefore, this method will open the doors for single-cell studies of gastrulating embryos that require genotyping.

저자 스포트라이트: 단일 세포 분해능에서 계통 특이적 돌연변이 배아를 분석하기 위한 파이프라인

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

이 논문에서 고안된 방법론은 E6.5에서 E8까지의 단세포 오믹스를 위한 배아 샘플의 준비를 향상시키기 위해 특별히 고안되었습니다. 이 강력한 파이프라인은 동기화된 시간 임신, 배아 분리, 당일 유전형 분석, 세포 해리 및 세포 생존력 평가의 5가지 주요 단계로 구성됩니다(그림 1A). 제시된 데이터는 E7에서 E7.5까지의 시점에 초점을 맞추고 있지만, 절차에서 약간의 변형을 ?...

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

single-cell-rna-sequencing-mutant-whole-mouse-embryos-from-epiblast

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

479 조회수.  Temple University, Lewis Katz School of Medicine. 우리는 배아 줄기 세포 분화 중 초기 세포 운명 결정을 제어하는 메커니즘을 해독하는 데 중점을 둡니다. 복잡한 조절 네트워크는 발달 과정에서 분화를 안내하며, 신호 전달 경로, 전사 인자 및 후성유전학적 조절 인자의 상호 작용이 어떻게 다른 세포의 운명을 촉진하는지 조사합니다. 생쥐의 역동적이고 빠른 위축 과정을 연구하는 것은 배아당 세...

비디오: 저자 스포트라이트: 단일 세포 분해능에서 계통 특이적 돌연변이 배아를 분석하기 위한 파이프라인

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.