Attine Ants' Gardens 的微生物群：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

我们研究了生活在真菌生长蚂蚁的真菌花园中的微生物群。我们想知道他们是谁以及他们如何组织这个微生物生态系统。特别是，我们想知道微生物群如何与蚂蚁培养的真菌进行物理相互作用。

而这些相互作用主要是由生物膜介导的。蚂蚁培养的微生物园是由培养的真菌、为培养而添加的基质和微生物群组成的复杂异质样品。除了非常脆弱之外，要找到保留所有花园成分以进行成像的方法也是一项挑战。

我们的研究结果表明，微生物群整合了真菌花园结构，也支持它们可能参与该环境的生理反应。我们还提供了一组证据，证明生物膜对这些相互作用很重要。我们的方案保留了生物膜中的真菌结构，同时简化了其他过程。

然而，它保留了精致的花园结构，进一步详细描述了微生物群的物理相互作用，并揭示了生物膜的空间结构。生物膜是细胞系统，其中嵌入 EPS 基质中的微生物形成社交网络。扫描电子显微镜使我们能够以前所未有的细节观察微生物群在真菌园、周围菌丝和整个基质中的空间组织方式。

我们相信，我们在这里建议的准备步骤将广泛应用于改进其他微生物生态系统的研究。首先，找到并标记 attine ant 物种群落。在巢区周围挖一条沟，直到花园房间暴露出来。

横向打开花园室，以防止土壤在花园表面塌陷。使用昆虫学镊子，仔细收集花园样本。将花园样品转移到装有一层石膏以平衡湿度的干净塑料容器中。

转移花园和蚂蚁工人后，将容器密封以防止样品干燥。使用先前去除的土壤封闭沟渠。将花园样品储存在 23 至 25 摄氏度，直到进一步加工。

对于样品固定，使用昆虫学镊子从花园样品中取出工蜂、卵、蛹和幼虫。将不超过 5 立方毫米的花园碎片放在一边，将它们加入 2 毫升的试管中。然后用巴斯德玻璃移液管向试管中加入大约 1 毫升的 Karnofsky 固定液，以完全浸没样品。

轻轻搅拌试管，让样品浸泡，并在 4 摄氏度下孵育样品至少 24 小时。首先，在 Karnofsky 固定液中获得 attine 蚂蚁物种群落片段。固定后，使用玻璃移液管完全去除 Karnofsky 固定液，而不会破坏样品。

将样品与 1 mL 浓度递增的乙醇连续孵育，确保样品不受干扰。完全去除乙醇后，使用镊子和抹刀，小心地将样品转移到临界点干燥器的样品容器中。将盖子盖在容器上，将其浸入含有足够 100% 乙醇的刻度玻璃烧杯中，以浸入容器。

然后将样品容器转移到另一个含有足够 100% 乙醇的刻度玻璃烧杯中。在室温下孵育 10 分钟。然后将容器转移到临界点干燥机。

首先，获得经过临界点干燥的 attine 蚂蚁物种群落片段。要制备样品架，请用一块铝箔包裹短板，仅覆盖顶部。在每个存根的底部写下示例代码或编号以识别它们，然后用双面碳带覆盖存根的上部。

然后打开标本容器的盖子，用镊子和抹刀小心地将干燥的样品转移到玻璃培养皿中。小心地将花园样品的碎片放在用胶带覆盖的存根的粘性表面上。用金溅射镀膜后，将存根放入样品架中进行扫描电子显微镜检查。

使用屏幕选项或手动控制来调整放大倍率和图像位置。移动载物台以获得样品的全面视图。使用 RDC 功能专注于特定领域。

观察有趣的结构时，请相应地调整放大倍率、焦点、亮度、对比度和柱痕。为了正确地标记，请使用手动用户界面，将舞台沿 X 和 Y 方向移动。调整光栅速率以检查图像分辨率。

根据要成像的零件调整放大倍率。要保存图像，请使用冻结功能并单击照片图标。设置用于保存图像的文件路径。

最后，分析至少三个花园碎片，在提到的所有放大倍率范围内捕获图像。在 attine 花园中观察到真菌菌丝为覆盖基质表面的完整管状结构，表明样品制备有效。扩散的生物膜由微生物细胞组成，形成覆盖基材表面的一到三个细胞薄层。