نحن نحقق في الجراثيم التي تعيش في حدائق الفطريات على النمل الذي ينمو الفطريات. نريد أن نعرف من هم وكيف ينظمون هذا النظام البيئي الميكروبي. على وجه الخصوص ، نريد أن نعرف كيف تتفاعل الجراثيم جسديا مع الفطريات التي يزرعها النمل.
ويتم التوسط في الغالب بين هذه التفاعلات الأغشية الحيوية. الحدائق الميكروبية التي يزرعها النمل هي عينة معقدة وغير متجانسة تتكون من الفطريات المزروعة والركيزة المضافة للزراعة والميكروبات. إلى جانب كونها حساسة للغاية ، من الصعب العثور على طرق تحافظ على جميع مكونات الحديقة للتصوير.
تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن الجراثيم تدمج هياكل حديقة الفطريات ، مما يدعم أيضا أنها قد تشارك في الاستجابات الفسيولوجية لهذه البيئة. ونقدم أيضا مجموعة من الأدلة على أن الأغشية الحيوية مهمة لهذه التفاعلات. يحافظ بروتوكولنا على هياكل الفطريات في الأغشية الحيوية مع تبسيط العمليات الأخرى.
ومع ذلك ، فإنه يحافظ على بنية الحديقة الدقيقة ، مما يزيد من تفصيل التفاعل المادي للميكروبات ويكشف النقاب عن الهيكل المكاني للأغشية الحيوية. Biofilm هي أنظمة خلوية تشكل فيها الكائنات الحية الدقيقة المضمنة في مصفوفة EPS شبكات اجتماعية. يمكننا الفحص المجهري الكهربائي من ملاحظة تفاصيل غير مسبوقة كيف تنظم الكائنات الحية الدقيقة مكانيا في حديقة الفطريات والخيوط المحيطة وفي جميع أنحاء الركيزة.
نعتقد أن خطوات التحضير التي نقترحها هنا سيتم تطبيقها على نطاق واسع لتحسين الدراسات في النظم البيئية الميكروبية الأخرى. للبدء ، حدد موقع مستعمرة أنواع النمل وقم بتمييزها. احفر خندقا يحيط بمنطقة العش حتى تنكشف غرفة الحديقة.
افتح حجرة الحديقة بشكل جانبي لمنع التربة من الانهيار فوق سطح الحديقة. باستخدام ملقط الحشرات ، اجمع عينات الحديقة بعناية. انقل عينات الحديقة إلى وعاء بلاستيكي نظيف يحتوي على طبقة من الجص لموازنة الرطوبة.
بعد نقل الحديقة وعمال النمل ، أغلق الحاوية بإحكام لمنع جفاف العينة. أغلق الخندق باستخدام التربة التي تمت إزالتها مسبقا. قم بتخزين عينات الحديقة على حرارة 23 إلى 25 درجة مئوية ، حتى مزيد من المعالجة.
لتثبيت العينة ، استخدم ملقط الحشرات لإزالة العمال والبيض والشرانق واليرقات من عينات الحديقة. ضع جانبا شظايا الحديقة التي لا يزيد حجمها عن خمسة ملليمترات مكعبة وأضفها إلى أنبوب ملليلتر. ثم باستخدام ماصة زجاجية باستور ، أضف ما يقرب من ملليلتر واحد من محلول التثبيت Karnofsky إلى الأنابيب لغمر العينات بالكامل.
حرك الأنبوب برفق للسماح للعينات بالنقع واحتضان العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل. للبدء ، احصل على شظايا مستعمرة أنواع النمل في محلول تثبيت كارنوفسكي. بعد التثبيت ، قم بإزالة محلول التثبيت الخاص ب Karnofsky تماما باستخدام ماصة زجاجية دون تعطيل العينة.
احتضان العينة بشكل متسلسل بملليلتر واحد من التركيزات المتزايدة من الإيثانول ، مما يضمن بقاء العينة دون إزعاج. بعد إزالة الإيثانول تماما ، باستخدام الملقط والملعقة ، انقل العينة بعناية إلى حاوية عينة لمجفف النقطة الحرجة. ضع الغطاء على الحاوية واغمره في دورق زجاجي متدرج يحتوي على ما يكفي من الإيثانول بنسبة 100٪ لغمر الحاوية.
ثم انقل حاوية العينة إلى دورق زجاجي متدرج آخر يحتوي على ما يكفي من الإيثانول بنسبة 100٪. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل الحاوية إلى مجفف النقطة الحرجة.
للبدء ، احصل على شظايا مستعمرة أنواع النمل اللطيفة المعرضة لتجفيف النقطة الحرجة. لتحضير حاملات العينات ، لف بذرة بقطعة من رقائق الألومنيوم ، تغطي الجزء العلوي فقط. اكتب نموذج التعليمات البرمجية أو الرقم في الجزء السفلي من كل كعب للتعرف عليها ، قبل تغطية الجزء العلوي من بذرة بشريط كربوني على الوجهين.
ثم افتح غطاء حاوية العينة وانقل العينة المجففة بعناية إلى طبق بتري زجاجي باستخدام ملقط وملعقة. ضع بعناية أجزاء من عينة الحديقة على السطح اللاصق للكعب المغطى بالشريط. بعد طلاء الرش بالذهب ، ضع بذرة في حامل العينة لمسح المجهر الإلكتروني.
استخدم إما الخيارات التي تظهر على الشاشة أو التحكم اليدوي لضبط التكبير وموضع الصورة. حرك المسرح للحصول على عرض شامل للعينة. استخدم وظيفة RDC للتركيز على مجالات محددة.
عند مراقبة هيكل مثير للاهتمام ، اضبط التكبير والتركيز والسطوع والتباين والوصمة وفقا لذلك. لتصحيح الوصم، باستخدام واجهة المستخدم اليدوية، حرك المرحلة في الاتجاهين X وY. اضبط معدل البيانات النقطية للتحقق من دقة الصورة.
اضبط التكبير وفقا للجزء الذي يتم تصويره. لحفظ الصورة ، استخدم وظيفة التجميد وانقر على أيقونة الصورة. قم بإعداد مسار الملف لحفظ الصورة.
أخيرا ، قم بتحليل ما لا يقل عن ثلاثة أجزاء من الحديقة ، والتقط الصور في جميع نطاقات التكبير المذكورة. لوحظت خيوط فطرية في حدائق أتين كهياكل سليمة على شكل أنبوب تغطي سطح الركيزة ، مما يشير إلى تحضير العينة بشكل فعال. تتكون الأغشية الحيوية المنتشرة من خلايا ميكروبية تشكل طبقة رقيقة من خلية واحدة إلى ثلاث خلايا تغطي سطح الركيزة.
