Мы исследуем микробиоту, которая живет в грибных садах на муравьях, выращивающих грибы. Мы хотим знать, кто они и как они организуют эту микробную экосистему. В частности, мы хотим знать, как микробиота физически взаимодействует с грибком, который культивируют муравьи.
И эти взаимодействия в основном опосредованы биопленкой. Микробные сады, культивируемые муравьями, представляют собой сложный и неоднородный образец, состоящий из культивируемого гриба, субстрата, добавленного для выращивания, и микробиоты. Помимо того, что это очень деликатный метод, сложно найти методы, которые сохраняют все компоненты сада для визуализации.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что микробиота интегрируется в садовые структуры грибов, что также подтверждает возможность их участия в физиологических реакциях этой среды. И мы также предоставляем набор доказательств того, что биопленки важны для этих взаимодействий. Наш протокол сохраняет структуры грибов в биопленках, упрощая при этом другие процессы.
Тем не менее, он сохраняет хрупкую структуру сада, еще больше детализируя физическое взаимодействие микробиоты и раскрывая пространственную структуру биопленки. Биопленки представляют собой клеточные системы, в которых микроорганизмы, встроенные в матрицу ЭПС, образуют социальные сети. Сканирующая электромикроскопия позволяет нам с беспрецедентной детализацией наблюдать, как микробиота организуется в грибном саду, вокруг гиф и по всему субстрату.
Мы полагаем, что предложенные нами подготовительные шаги будут широко применяться для уточнения исследований в других микробных экосистемах. Для начала найдите и отметьте колонию видов муравьев Аттин. Выкопайте траншею вокруг гнезда, пока садовая камера не обнаружится.
Откройте садовую камеру сбоку, чтобы почва не обрушивалась на поверхность сада. С помощью энтомологических щипцов тщательно соберите садовые пробы. Переложите садовые образцы в чистый пластиковый контейнер, содержащий слой штукатурки, чтобы сбалансировать влажность.
После переноса садовых и муравьиных тружеников герметично закройте емкость, чтобы предотвратить высыхание образца. Закройте траншею, используя предварительно снятый грунт. Храните садовые образцы при температуре от 23 до 25 градусов Цельсия, до дальнейшей обработки.
Для фиксации образца используйте энтомологические щипцы для удаления рабочих особей, яиц, куколок и личинок из садовых образцов. Отложите садовые фрагменты размером не более пяти кубических миллиметров и добавьте их в двухмиллилитровую трубку. Затем с помощью стеклянной пипетки Пастера добавьте в пробирки примерно один миллилитр фиксирующего раствора Карновского, чтобы полностью погрузить образцы.
Осторожно перемешайте пробирку, чтобы образцы впитались, и инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение не менее 24 часов. Для начала получите фрагменты колонии вида муравьев в фиксирующем растворе Карновского. После фиксации полностью удалите фиксирующий раствор Карновски с помощью стеклянной пипетки, не нарушая образец.
Последовательно инкубируйте образец с одним миллилитром возрастающей концентрации этанола, следя за тем, чтобы образец оставался нетронутым. После полного удаления этанола с помощью щипцов и шпателя осторожно перенесите образец в контейнер для образцов для сушилки для критических точек. Накройте контейнер крышкой и погрузите его в стакан из градуированного стекла, содержащий достаточное количество 100% этанола для погружения контейнера.
Затем переложите контейнер с образцом в другой стакан из градуированного стекла, содержащий достаточное количество 100% этанола. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. Затем перенесите контейнер в сушилку для критических точек.
Для начала необходимо получить аттину видов фрагментов колонии муравьев, подвергнутых критической точечной сушке. Чтобы подготовить держатели для образцов, оберните огрызки куском алюминиевой фольги, накрыв только верх. Напишите образец кода или номер на нижней части каждого заглушки, чтобы идентифицировать их, прежде чем накрыть верхнюю часть заглушек двусторонней угольной лентой.
Затем откройте крышку контейнера для образцов и осторожно переложите высушенный образец в стеклянную чашку Петри с помощью щипцов и шпателя. Аккуратно выложите фрагменты садового образца на липкую поверхность обмотанного скотчем пня. После нанесения покрытия золотом поместите заглушки в держатель образца для сканирующей электронной микроскопии.
Используйте экранные опции или ручное управление для регулировки увеличения и положения изображения. Переместите рабочую область, чтобы получить полное представление о образце. Используйте функцию RDC, чтобы сосредоточиться на конкретных областях.
Наблюдая за интересной структурой, отрегулируйте увеличение, фокус, яркость, контраст и стигматацию соответственно. Для правильной стигмации, используя ручной пользовательский интерфейс, перемещайте сцену в направлениях X и Y. Отрегулируйте скорость растра, чтобы проверить разрешение изображения.
Отрегулируйте увеличение в соответствии с изображением детали. Чтобы сохранить изображение, воспользуйтесь функцией заморозки и нажмите на иконку фотографии. Настройте путь к файлу для сохранения изображения.
Наконец, проанализируйте как минимум три фрагмента сада, захватывая изображения во всех упомянутых диапазонах увеличения. Гифы грибов в садах аттина наблюдались как неповрежденные трубчатые структуры, покрывающие поверхность субстрата, что указывает на эффективную подготовку образцов. Распространяемые биопленки состояли из микробных клеток, образующих тонкий слой из одной-трех клеток, покрывающий поверхность субстрата.
