Investigamos a microbiota que vive em jardins de fungos em formigas cultivadoras de fungos. Queremos saber quem são e como estão organizando esse ecossistema microbiano. Em particular, queremos saber como a microbiota interage fisicamente com o fungo que as formigas cultivam.
E essas interações são mediadas principalmente por biofilme. Os jardins microbianos cultivados pelas formigas são uma amostra complexa e heterogênea composta pelo fungo cultivado, substrato adicionado para cultivo e pela microbiota. Além de ser muito delicado, é um desafio encontrar métodos que preservem todos os componentes do jardim para a geração de imagens.
Nossos achados sugerem que a microbiota integra as estruturas do jardim de fungos, também sustentando que eles podem participar das respostas fisiológicas desse ambiente. E também fornecemos o conjunto de evidências de que os biofilmes são importantes para essas interações. Nosso protocolo preserva estruturas de fungos em biofilmes enquanto simplifica outros processos.
No entanto, preserva a delicada estrutura do jardim, detalhando ainda mais a interação física da microbiota e revelando a estrutura espacial do biofilme. Os biofilmes são sistemas celulares nos quais microrganismos embutidos em uma matriz EPS formam redes sociais. A eletromicroscopia de varredura nos permite observar com detalhes sem precedentes como a microbiota se organiza espacialmente no jardim de fungos, nas hifas circundantes e em todo o substrato.
Acreditamos que as etapas de preparação que sugerimos aqui serão amplamente aplicadas para refinar estudos em outros ecossistemas microbianos. Para começar, localize e marque a colônia de espécies de formigas attinas. Escave uma trincheira ao redor da área do ninho até que a câmara do jardim fique exposta.
Abra a câmara do jardim lateralmente para evitar que o solo desmorone sobre a superfície do jardim. Usando uma pinça entomológica, colete cuidadosamente amostras de jardim. Transfira as amostras do jardim para um recipiente de plástico limpo contendo uma camada de gesso para equilibrar a umidade.
Depois de transferir o jardim e as formigas, feche hermeticamente o recipiente para evitar a secagem da amostra. Feche a vala usando o solo removido anteriormente. Armazene as amostras de jardim a 23 a 25 graus Celsius, até processamento posterior.
Para fixação da amostra, use uma pinça entomológica para remover operárias, ovos, pupas e larvas das amostras do jardim. Reserve fragmentos de jardim não maiores que cinco milímetros cúbicos e adicione-os a um tubo de dois mililitros. Em seguida, com uma pipeta de vidro pasteur, adicione aproximadamente um mililitro de solução fixadora de Karnofsky aos tubos para submergir completamente as amostras.
Agite o tubo suavemente para deixar as amostras de molho e incubar as amostras a quatro graus Celsius por pelo menos 24 horas. Para começar, obtenha fragmentos de colônias de espécies de formigas attine em solução fixadora de Karnofsky. Após a fixação, remova completamente a solução fixadora de Karnofsky usando uma pipeta de vidro sem interromper a amostra.
Incube em série a amostra com um mililitro de concentrações crescentes de etanol, garantindo que a amostra permaneça intacta. Depois de remover completamente o etanol, usando fórceps e espátula, transfira cuidadosamente a amostra para um recipiente de amostra para o secador de ponto crítico. Coloque a tampa no recipiente e mergulhe-o em um copo de vidro graduado contendo 100% de etanol suficiente para submergir o recipiente.
Em seguida, transfira o recipiente de amostra para outro copo de vidro graduado contendo 100% de etanol suficiente. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira o recipiente para o secador de ponto crítico.
Para começar, obter fragmentos de colônias de espécies de formigas attine submetidas à secagem em pontos críticos. Para preparar os porta-amostras, embrulhe os tocos com um pedaço de papel alumínio, cobrindo apenas a parte superior. Escreva o código ou número de amostra na parte inferior de cada cano para identificá-los, antes de cobrir a parte superior dos tocos com fita de carbono dupla face.
Em seguida, abra a tampa do recipiente de amostra e transfira cuidadosamente a amostra seca para uma placa de Petri de vidro usando uma pinça e uma espátula. Coloque cuidadosamente os fragmentos da amostra de jardim na superfície pegajosa do toco coberto com fita. Após o revestimento por pulverização catódica com ouro, coloque os tocos no porta-amostras para microscopia eletrônica de varredura.
Use as opções na tela ou o controle manual para ajustar a ampliação e a posição da imagem. Mova o palco para obter uma visão abrangente da amostra. Empregue a função RDC para se concentrar em áreas específicas.
Ao observar uma estrutura interessante, ajuste a ampliação, o foco, o brilho, o contraste e a estigmatização de acordo. Para a estigmatização correta, usando a interface de usuário manual, mova o palco nas direções X e Y. Ajuste a taxa de varredura para verificar a resolução da imagem.
Ajuste a ampliação de acordo com a peça que está sendo fotografada. Para salvar a imagem, use a função de congelamento e clique no ícone da foto. Configure o caminho do arquivo para salvar a imagem.
Por fim, analise pelo menos três fragmentos de jardim, capturando imagens em todas as faixas de ampliação mencionadas. As hifas fúngicas em jardins attine foram observadas como estruturas intactas em forma de tubo cobrindo a superfície do substrato, indicando uma preparação eficaz da amostra. Os biofilmes espalhados consistiram em células microbianas formando uma fina camada de uma a três células cobrindo a superfície do substrato.
