Mantar bahçelerinde yaşayan mikrobiyotayı mantar yetiştiren karıncalar üzerinde araştırıyoruz. Kim olduklarını ve bu mikrobiyal ekosistemi nasıl organize ettiklerini bilmek istiyoruz. Özellikle, mikrobiyotanın karıncaların yetiştirdiği mantarla fiziksel olarak nasıl etkileşime girdiğini bilmek istiyoruz.
Ve bu etkileşimlere çoğunlukla biyofilm aracılık eder. Karıncalar tarafından yetiştirilen mikrobiyal bahçeler, ekili mantar, yetiştirme için eklenen substrat ve mikrobiyota tarafından oluşturulan karmaşık ve heterojen bir örnektir. Çok hassas olmasının yanı sıra, görüntüleme için tüm bahçe bileşenlerini koruyan yöntemler bulmak zordur.
Bulgularımız, mikrobiyotanın mantar bahçesi yapılarını bütünleştirdiğini ve aynı zamanda bu ortamın fizyolojik tepkilerine katılabileceklerini desteklediğini göstermektedir. Ayrıca, biyofilmlerin bu etkileşimler için önemli olduğuna dair bir dizi kanıt da sunuyoruz. Protokolümüz, biyofilmlerdeki mantar yapılarını korurken diğer süreçleri basitleştirir.
Yine de hassas bahçe yapısını koruyarak mikrobiyotanın fiziksel etkileşimini daha da detaylandırıyor ve biyofilmin mekansal yapısını ortaya çıkarıyor. Biyofilmler, bir EPS matrisine gömülü mikroorganizmaların sosyal ağlar oluşturduğu hücresel sistemlerdir. Taramalı elektro mikroskopi, mikrobiyotanın mantar bahçesinde, çevredeki hiflerde ve alt tabakanın her yerinde mekansal olarak nasıl organize olduğunu benzeri görülmemiş ayrıntılarla gözlemlememizi sağlar.
Burada önerdiğimiz hazırlık adımlarının, diğer mikrobiyal ekosistemlerdeki çalışmaları rafine etmek için yaygın olarak uygulanacağına inanıyoruz. Başlamak için, attine karınca türü kolonisini bulun ve işaretleyin. Bahçe odası açığa çıkana kadar yuva alanını çevreleyen bir hendek kazın.
Toprağın bahçe yüzeyine çökmesini önlemek için bahçe odasını yanlamasına açın. Entomolojik forseps kullanarak bahçe örneklerini dikkatlice toplayın. Bahçe numunelerini nemi dengelemek için bir sıva tabakası içeren temiz bir plastik kaba aktarın.
Bahçe ve karınca işçilerini aktardıktan sonra, numunenin kurumasını önlemek için kabı hava geçirmez şekilde kapatın. Önceden çıkarılmış toprağı kullanarak açmayı kapatın. Bahçe numunelerini daha sonraki işlemlere kadar 23 ila 25 santigrat derecede saklayın.
Numune fiksasyonu için, bahçe örneklerinden işçileri, yumurtaları, pupaları ve larvaları çıkarmak için entomolojik forseps kullanın. Beş milimetre küpten büyük olmayan bahçe parçalarını bir kenara koyun ve iki mililitrelik bir tüpe ekleyin. Daha sonra bir pastör cam pipet ile, numuneleri tamamen daldırmak için tüplere yaklaşık bir mililitre Karnofsky fiksatif solüsyonu ekleyin.
Numunelerin ıslanmasına izin vermek için tüpü hafifçe çalkalayın ve numuneleri en az 24 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Başlamak için, Karnofsky fiksatif çözeltisinde attine karınca türleri koloni fragmanları elde edin. Fiksasyondan sonra, numuneyi bozmadan bir cam pipet kullanarak Karnofsky'nin fiksatif solüsyonunu tamamen çıkarın.
Numuneyi bir mililitre artan konsantrasyonlarda etanol ile seri olarak inkübe edin ve numunenin bozulmadan kalmasını sağlayın. Etanolü forseps ve spatula kullanarak tamamen çıkardıktan sonra, numuneyi kritik nokta kurutucu için bir numune kabına dikkatlice aktarın. Kapağı kabın üzerine yerleştirin ve kabı daldırmaya yetecek kadar %100 etanol içeren dereceli bir cam kabın içine daldırın.
Daha sonra numune kabını, yeterli miktarda %100 etanol içeren başka bir dereceli cam behere aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından kabı kritik nokta kurutucusuna aktarın.
Başlamak için, kritik nokta kurutmasına tabi tutulan attine ant türü koloni parçalarını elde edin. Numune tutucuları hazırlamak için, saplamaları sadece üst kısmı kaplayacak şekilde bir parça alüminyum folyo ile sarın. Saplamaların üst kısmını çift taraflı karbon bantla kaplamadan önce, bunları tanımlamak için her bir saplamanın altına örnek kodunu veya numarasını yazın.
Daha sonra numune kabının kapağını açın ve kurutulmuş numuneyi forseps ve bir spatula kullanarak dikkatlice bir cam Petri kabına aktarın. Bahçe numunesinin parçalarını bantla kaplı saplamanın yapışkan yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Altınla püskürtüldükten sonra, elektron mikroskobu taramak için saplamaları numune tutucuya yerleştirin.
Büyütmeyi ve görüntü konumunu ayarlamak için ekrandaki seçenekleri veya manuel kontrolü kullanın. Numunenin kapsamlı bir görünümünü elde etmek için sahneyi hareket ettirin. Belirli alanlara odaklanmak için RDC işlevini kullanın.
İlginç bir yapıyı gözlemlerken, büyütmeyi, odaklamayı, parlaklığı, kontrastı ve damgalamayı buna göre ayarlayın. Doğru damgalama için, manuel kullanıcı arayüzünü kullanarak, sahneyi X ve Y yönlerinde hareket ettirin. Görüntü çözünürlüğünü kontrol etmek için raster hızını ayarlayın.
Büyütmeyi görüntülenen parçaya göre ayarlayın. Görüntüyü kaydetmek için dondurma işlevini kullanın ve fotoğraf simgesine tıklayın. Görüntüyü kaydetmek için dosya yolunu ayarlayın.
Son olarak, belirtilen tüm büyütme aralıklarında görüntüler yakalayarak en az üç bahçe parçasını analiz edin. Attine bahçelerindeki mantar hifleri, substrat yüzeyini kaplayan sağlam tüp şeklindeki yapılar olarak gözlemlendi ve bu da etkili numune hazırlamayı gösterdi. Yayılmış biyofilmler, substrat yüzeyini kaplayan ince bir ila üç hücreli tabaka oluşturan mikrobiyal hücrelerden oluşuyordu.
