우리는 곰팡이 성장 개미의 곰팡이 정원에 사는 미생물군을 조사합니다. 우리는 그들이 누구이며 이 미생물 생태계를 어떻게 조직하고 있는지 알고 싶습니다. 특히, 우리는 미생물총(microbiota)이 개미가 재배하는 곰팡이와 물리적으로 어떻게 상호 작용하는지 알고 싶습니다.
그리고 이러한 상호 작용은 대부분 생물막에 의해 매개됩니다. 개미가 재배하는 미생물 정원은 배양된 곰팡이, 배양을 위해 첨가된 기질 및 미생물총(microbiota)으로 구성된 복잡하고 이질적인 샘플입니다. 매우 섬세할 뿐만 아니라 이미징을 위해 모든 정원 구성 요소를 보존하는 방법을 찾는 것이 어렵습니다.
우리의 연구 결과는 미생물총(microbiota)이 곰팡이 정원 구조를 통합하고 이러한 환경의 생리적 반응에 참여할 수 있음을 뒷받침합니다. 또한 생물막이 이러한 상호 작용에 중요하다는 일련의 증거를 제공합니다. 당사의 프로토콜은 생물막의 곰팡이 구조를 보존하는 동시에 다른 프로세스를 단순화합니다.
그러나 섬세한 정원 구조를 보존하여 미생물총의 물리적 상호 작용을 더욱 자세히 설명하고 생물막의 공간 구조를 밝힙니다. 생물막은 EPS 매트릭스에 내장된 미생물이 소셜 네트워크를 형성하는 세포 시스템입니다. 스캐닝 전기 현미경을 통해 미생물총(microbiota)이 곰팡이 정원, 주변 균사 및 기질 전체에서 어떻게 공간적으로 구성되는지 전례 없이 자세히 관찰할 수 있습니다.
우리는 여기에서 제안하는 준비 단계가 다른 미생물 생태계에서 연구를 개선하는 데 널리 적용될 것이라고 믿습니다. 시작하려면 attine 개미 종 군체를 찾아 표시하십시오. 정원 방이 드러날 때까지 둥지 지역을 둘러싼 도랑을 파십시오.
흙이 정원 표면 위로 무너지는 것을 방지하기 위해 정원 챔버를 옆으로 엽니다. 곤충학 겸자를 사용하여 정원 샘플을 조심스럽게 수집합니다. 습도의 균형을 맞추기 위해 석고 층이 들어있는 깨끗한 플라스틱 용기에 정원 샘플을 옮깁니다.
정원과 개미 일꾼을 옮긴 후 샘플 건조를 방지하기 위해 용기를 밀폐합니다. 이전에 제거한 토양을 사용하여 트렌치를 닫습니다. 추가 처리가 있을 때까지 정원 샘플을 섭씨 23도에서 25도에 보관하십시오.
샘플 고정을 위해 곤충학 겸자를 사용하여 정원 샘플에서 작업자, 알, 번데기 및 유충을 제거합니다. 5입방밀리미터 이하의 정원 조각을 따로 보관하고 2밀리리터 튜브에 넣으십시오. 그런 다음 파스퇴르 유리 피펫을 사용하여 약 1ml의 Karnofsky 고정 용액을 튜브에 추가하여 샘플을 완전히 담그십시오.
샘플을 담가두기 위해 튜브를 부드럽게 저어주고 최소 24시간 동안 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다. 시작하려면 Karnofsky 고정 용액에서 attine 개미 종 군집 조각을 얻습니다. 고정 후 샘플을 방해하지 않고 유리 피펫을 사용하여 Karnofsky의 고정 용액을 완전히 제거합니다.
농도가 1ml씩 증가하는 에탄올로 샘플을 연속적으로 배양하여 샘플이 방해받지 않도록 합니다. 에탄올을 완전히 제거한 후 겸자와 주걱을 사용하여 샘플을 임계점 건조기용 검체 용기에 조심스럽게 옮깁니다. 용기에 뚜껑을 덮고 용기를 담글 수 있을 만큼 충분한 100% 에탄올이 들어 있는 눈금이 매겨진 유리 비커에 담그십시오.
그런 다음 표본 용기를 100% 에탄올이 충분히 함유된 다른 눈금이 매겨진 유리 비커로 옮깁니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 용기를 임계점 건조기로 옮깁니다.
시작하려면 임계점 건조를 거친 attine 개미 종 군체 조각을 얻습니다. 샘플 홀더를 준비하려면 상단만 덮는 알루미늄 호일 조각으로 스텁을 감쌉니다. 각 스텁의 하단에 샘플 코드 또는 번호를 작성하여 식별한 후 스텁의 윗부분을 양면 탄소 테이프로 덮습니다.
그런 다음 표본 용기의 뚜껑을 열고 집게와 주걱을 사용하여 건조된 샘플을 유리 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 테이프로 덮인 스텁의 끈적 끈적한 표면에 정원 샘플의 조각을 조심스럽게 놓습니다. 금으로 스퍼터 코팅한 후 주사 전자 현미경을 위해 샘플 홀더에 스텁을 놓습니다.
화면 옵션 또는 수동 제어를 사용하여 배율과 이미지 위치를 조정합니다. 스테이지를 이동하여 샘플에 대한 포괄적인 보기를 얻을 수 있습니다. RDC 기능을 사용하여 특정 영역에 집중할 수 있습니다.
흥미로운 구조를 관찰할 때 그에 따라 배율, 초점, 밝기, 대비 및 암술을 조정하십시오. 올바른 낙인을 찍으려면 수동 사용자 인터페이스를 사용하여 스테이지를 X 및 Y 방향으로 이동합니다. 래스터 속도를 조정하여 이미지 해상도를 확인합니다.
이미징되는 부분에 따라 배율을 조정합니다. 이미지를 저장하려면 고정 기능을 사용하고 사진 아이콘을 클릭하십시오. 이미지를 저장할 파일 경로를 설정합니다.
마지막으로, 최소 3개의 정원 조각을 분석하여 언급된 모든 배율 범위에서 이미지를 캡처합니다. attine 정원의 곰팡이 균사는 기질 표면을 덮고 있는 손상되지 않은 튜브 모양의 구조로 관찰되었으며, 이는 효과적인 샘플 준비를 나타냅니다. 스프레드 생물막은 기질 표면을 덮고 있는 얇은 1-3 세포 층을 형성하는 미생물 세포로 구성되었습니다.
