私たちは、菌類を育てるアリの菌類園に生息する微生物叢を調査します。私たちは、彼らが誰で、この微生物エコシステムをどのように組織化しているのかを知りたいのです。特に、微生物叢がアリが培養する菌類と物理的にどのように相互作用するかを知りたいと考えています。
そして、これらの相互作用は主にバイオフィルムによって媒介されます。アリによって栽培された微生物ガーデンは、栽培された真菌、栽培のために添加された基質、および微生物叢によって構成された複雑で不均一なサンプルです。非常に繊細であるだけでなく、イメージングのためにすべての庭のコンポーネントを保存する方法を見つけることは困難です。
私たちの発見は、微生物叢が菌類の庭の構造を統合し、彼らがこの環境の生理学的応答に関与している可能性があることを裏付けていることを示唆しています。また、バイオフィルムがこれらの相互作用に重要であるという一連の証拠も提供しています。私たちのプロトコルは、バイオフィルム内の真菌構造を維持しながら、他のプロセスを簡素化します。
しかし、繊細な庭園の構造はそのままに、微生物叢の物理的な相互作用をさらに詳細に表現し、バイオフィルムの空間構造を明らかにしています。バイオフィルムは、EPSマトリックスに埋め込まれた微生物がソーシャルネットワークを形成する細胞システムです。走査型電子顕微鏡により、微生物叢が菌類園、周囲の菌糸、および基質全体でどのように空間的に組織化しているかをこれまでにない詳細に観察することができます。
ここで提案する準備手順は、他の微生物生態系での研究を洗練するために広く適用されると信じています。まず、アティネアリ種のコロニーを見つけてマークします。庭の部屋が露出するまで、巣の周りを囲む溝を掘ります。
庭の部屋を横に開いて、土が庭の表面に崩れ落ちるのを防ぎます。昆虫学的鉗子を使用して、庭のサンプルを慎重に収集します。庭のサンプルを漆喰の層が入ったきれいなプラスチック容器に移して、湿度のバランスを取ります。
庭とアリの労働者を移した後、サンプルの乾燥を防ぐために容器を密閉します。以前に取り除いた土を使用してトレンチを閉じます。庭のサンプルは、さらに処理されるまで、摂氏23〜25度で保管します。
サンプルの固定には、昆虫学的鉗子を使用して、庭のサンプルから働きバチ、卵、蛹、幼虫を取り除きます。5立方ミリメートル以下の庭の破片を脇に置き、それらを2ミリリットルのチューブに加えます。次に、パスツールガラスピペットを使用して、約1ミリリットルのカルノフスキー固定液をチューブに加えて、サンプルを完全に沈めます。
チューブを静かに攪拌してサンプルを浸し、摂氏4度で少なくとも24時間インキュベートします。まず、カルノフスキー固定液中のアティーネアリ種のコロニーフラグメントを入手します。固定後、サンプルを乱さずにガラスピペットを使用してカルノフスキーの固定液を完全に除去します。
サンプルを1ミリリットルの高濃度のエタノールと連続的にインキュベートし、サンプルが乱されないようにします。エタノールを完全に除去した後、鉗子とヘラを使用して、サンプルを臨界点乾燥機用の試料容器に慎重に移します。容器に蓋をして、容器を沈めるのに十分な100%エタノールを含む目盛り付きガラスビーカーに浸します。
次に、試料容器を十分な100%エタノールを含む別の目盛り付きガラスビーカーに移します。室温で10分間インキュベートします。次に、コンテナを臨界点乾燥機に移します。
まず、臨界点乾燥を受けたアリ種のコロニーフラグメントを取得します。サンプルホルダーを準備するには、スタブをアルミホイルで包み、上部のみを覆います。各スタブの下部にサンプルコードまたは番号を記入して識別し、スタブの上部を両面カーボンテープで覆います。
次に、試料容器の蓋を開け、鉗子とへらを使用して、乾燥したサンプルをガラス製のシャーレに慎重に移します。庭のサンプルの断片を、テープで覆われたスタブの粘着性のある表面に慎重に置きます。金でスパッタコーティングした後、スタブを走査型電子顕微鏡用のサンプルホルダーに置きます。
画面上のオプションまたは手動制御を使用して、倍率と画像の位置を調整します。ステージを動かして、サンプルの全体像を把握します。RDC機能を使用して、特定の領域に焦点を当てます。
興味深い構造を観察するときは、それに応じて倍率、焦点、明るさ、コントラスト、スティグマを調整します。正しいスティグマを得るには、手動ユーザーインターフェースを使用して、ステージをX方向とY方向に動かします。ラスター レートを調整して、画像の解像度を確認します。
画像化するパーツに合わせて倍率を調整してください。画像を保存するには、フリーズ機能を使用して写真アイコンをクリックします。画像を保存するためのファイルパスを設定します。
最後に、少なくとも 3 つの庭の断片を分析し、言及されているすべての倍率範囲で画像をキャプチャします。アティーネガーデンの菌類菌糸は、基質表面を覆う無傷の管状の構造として観察され、効果的なサンプル調製を示しました。拡散バイオフィルムは、基質表面を覆う薄い1〜3細胞層を形成する微生物細胞で構成されていました。
