Nous étudions le microbiote qui vit dans les jardins de champignons sur les fourmis qui cultivent des champignons. Nous voulons savoir qui ils sont et comment ils organisent cet écosystème microbien. En particulier, nous voulons savoir comment le microbiote interagit physiquement avec le champignon que les fourmis cultivent.
Et ces interactions sont principalement médiées par le biofilm. Les jardins microbiens cultivés par les fourmis sont un échantillon complexe et hétérogène composé du champignon cultivé, du substrat ajouté pour la culture et du microbiote. En plus d’être très délicat, il est difficile de trouver des méthodes qui préservent tous les composants du jardin pour l’imagerie.
Nos résultats suggèrent que le microbiote intègre les structures du jardin de champignons, ce qui soutient également qu’ils peuvent participer aux réponses physiologiques de cet environnement. Et nous fournissons également l’ensemble des preuves que les biofilms sont importants pour ces interactions. Notre protocole préserve les structures fongiques dans les biofilms tout en simplifiant les autres processus.
Pourtant, il préserve la structure délicate du jardin, détaillant davantage l’interaction physique du microbiote et dévoilant la structure spatiale du biofilm. Les biofilms sont des systèmes cellulaires dans lesquels des micro-organismes intégrés dans une matrice EPS forment des réseaux sociaux. L’électromicroscopie à balayage nous permet d’observer avec un niveau de détail sans précédent comment le microbiote s’organise spatialement dans le jardin de champignons, autour des hyphes et sur tout le substrat.
Nous croyons que les étapes de préparation que nous suggérons ici seront largement appliquées pour affiner les études dans d’autres écosystèmes microbiens. Pour commencer, localisez et marquez la colonie d’espèces de fourmis attines. Creusez une tranchée autour de la zone du nid jusqu’à ce que la chambre de jardin soit exposée.
Ouvrez la chambre de jardin latéralement pour éviter que le sol ne s’effondre sur la surface du jardin. À l’aide d’une pince entomologique, prélever soigneusement des échantillons de jardin. Transférez les échantillons de jardin dans un récipient en plastique propre contenant une couche de plâtre pour équilibrer l’humidité.
Après avoir transféré les ouvrières du jardin et des fourmis, fermez hermétiquement le récipient pour éviter le dessèchement de l’échantillon. Fermez la tranchée en utilisant la terre préalablement enlevée. Conservez les échantillons de jardin à une température de 23 à 25 degrés Celsius, jusqu’à ce qu’ils soient transformés.
Pour la fixation des échantillons, utilisez des pinces entomologiques pour retirer les ouvrières, les œufs, les pupes et les larves des échantillons du jardin. Mettez de côté les fragments de jardin ne dépassant pas cinq millimètres cubes et ajoutez-les dans un tube de deux millilitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre pasteur, ajoutez environ un millilitre de solution fixatrice Karnofsky dans les tubes pour immerger complètement les échantillons.
Agitez doucement le tube pour laisser tremper les échantillons et incubez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Pour commencer, obtenez des fragments de colonie d’espèces de fourmis attine dans la solution fixative de Karnofsky. Après la fixation, retirez complètement la solution fixatrice de Karnofsky à l’aide d’une pipette en verre sans perturber l’échantillon.
Incuber en série l’échantillon avec un millilitre de concentrations croissantes d’éthanol, en veillant à ce que l’échantillon ne soit pas perturbé. Après avoir complètement retiré l’éthanol, à l’aide d’une pince et d’une spatule, transférez soigneusement l’échantillon dans un récipient d’échantillon pour le sécheur de point critique. Placez le couvercle sur le récipient et plongez-le dans un bécher en verre gradué contenant suffisamment d’éthanol à 100 % pour immerger le récipient.
Transférez ensuite le récipient de l’échantillon dans un autre bécher en verre gradué contenant suffisamment d’éthanol à 100 %. Incuber 10 minutes à température ambiante. Transférez ensuite le récipient dans le séchoir à point critique.
Pour commencer, obtenez des fragments de colonie d’espèces de fourmis attine soumis à un séchage au point critique. Pour préparer les porte-échantillons, enveloppez les talons avec un morceau de papier d’aluminium, en ne recouvrant que le dessus. Écrivez le code ou le numéro de l’échantillon au bas de chaque talon pour les identifier, avant de recouvrir la partie supérieure des talons avec du ruban carbone double face.
Ouvrez ensuite le couvercle du récipient de l’échantillon et transférez soigneusement l’échantillon séché dans une boîte de Pétri en verre à l’aide d’une pince et d’une spatule. Placez soigneusement des fragments de l’échantillon de jardin sur la surface collante du talon recouvert de ruban adhésif. Après avoir recouvert d’or par pulvérisation, placez les talons dans le porte-échantillon pour la microscopie électronique à balayage.
Utilisez les options à l’écran ou la commande manuelle pour ajuster l’agrandissement et la position de l’image. Déplacez la platine pour obtenir une vue complète de l’échantillon. Utiliser la fonction de CDR pour se concentrer sur des domaines précis.
Lorsque vous observez une structure intéressante, ajustez le grossissement, la mise au point, la luminosité, le contraste et la stigmatisation en conséquence. Pour une stigmatisation correcte, à l’aide de l’interface utilisateur manuelle, déplacez la platine dans les directions X et Y. Ajustez la fréquence raster pour vérifier la résolution de l’image.
Ajustez l’agrandissement en fonction de la pièce imagée. Pour enregistrer l’image, utilisez la fonction de gel et cliquez sur l’icône de la photo. Configurez le chemin d’accès au fichier pour l’enregistrement de l’image.
Enfin, analysez au moins trois fragments de jardin, en capturant des images à toutes les plages de grossissement mentionnées. Les hyphes fongiques dans les jardins d’attines ont été observés sous forme de structures tubulaires intactes recouvrant la surface du substrat, indiquant une préparation efficace des échantillons. Les biofilms étalés étaient constitués de cellules microbiennes formant une fine couche d’une à trois cellules recouvrant la surface du substrat.
