测量完整小鼠神经视网膜中葡萄糖类似物 6-（N-（7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基）-6-脱氧葡萄糖的摄取

我们的实验室研究视网膜和整个中枢神经系统的代谢变化，这些变化随年龄的增长以及神经退行性疾病而发生。我们的首要目标是利用这些发现来确定治疗与年龄相关的神经退行性疾病的新治疗靶点。检测视网膜组织中的葡萄糖摄取通常既昂贵又耗时，需要复杂的成像方式甚至放射性物质。

我们建立了这个协议，以提供一种新的离体技术来测量视网膜样本中的荧光葡萄糖类似物摄取。我们开发的方案提供了一种简单且具有成本效益的策略来测量荧光葡萄糖类似物对整个完整视网膜的离体摄取。这种方法也是有利的，因为它允许研究人员同时测量多个样品。

该协议将使研究人员能够评估视网膜对荧光葡萄糖类似物摄取的变化，这将有助于我们更好地了解视网膜如何利用葡萄糖作为能量底物，无论是随着年龄的增长，还是在健康和疾病状态下。首先，在 50% DMSO 和 PBS 的混合物中制备 5 毫摩尔 6-NBDG 的储备溶液。在零下 500 摄氏度下储存 20 微升等分试样的溶液。

将含有不含葡萄糖的 Neurobasal-A 培养基的 50 mL 锥形管置于冰上。将 1.5 毫升微量离心管标记为葡萄糖饥饿、6-NBDG 孵育、超声处理和穿刺测定的样品采集。将 100 μL 冷冻的 Neurobasal-A 培养基添加到冰上预先标记的超声管中。

打开读板器的电源。使用荧光终点测定功能在读板器软件中设置板参数，激发设置为 483 纳米，发射设置为 550 纳米，截止设置为 530 纳米。在 Neurobasal-A 培养基中稀释 6 个 NBDG 的 5 毫摩尔储备液，制备 500 微摩尔的工作溶液，并用铝箔覆盖以避光。

将 200 微升工作溶液移液到预先标记的 6-NBDG 孵育管中，并如图所示盖上盖子。使用修剪过的移液管或镊子从安乐死的小鼠中分离视网膜后，将视网膜转移到含有 200 微升 Neurobasal-A 培养基的 1.5 毫升试管中，用于葡萄糖饥饿。将试管置于 37 摄氏度的水浴中孵育 20 分钟。

将视网膜转移到含有 200 μL 500 μmol 6-NBDG 的 Neurobasal-A 培养基中的预标记管中。将试管置于 37 摄氏度的水浴中孵育 60 分钟。要制备 6-NBDG 标准品，请将 8 个 1.5 mL 微量离心管标记为标准品 1 至 8。

对于标准溶液，将 32 微升 500 微摩尔 6-NBDG 储备液移液到标记的试管中。然后向试管中加入 368 μL Neurobasal-A 培养基，并通过上下吹打充分混合。用铝箔覆盖所有管子。

60 分钟 6-NBDG 孵育后，从 37 摄氏度的水浴中取出试管。要清洗视网膜，使用移液管去除 6-NBDG 溶液，不要干扰视网膜组织，并在冰上加入 500 微升新鲜冰冷的 Neurobasal-A 培养基。接下来，使用镊子小心地将视网膜转移到含有冰上 Neurobasal-A 培养基的超声管中。

使用小解剖剪刀，将视网膜切成小块。以 10 的振幅对每个视网膜进行 5 到 10 秒的超声处理，然后立即将试管放回冰上。将样品在 21， 130 G 和 4 摄氏度下离心 15 分钟。

将 100 μL 上清液转移到 96 孔板中。将板插入读板器。选择具有指定波长的荧光终点检测。

运行检测并保存结果。运行后，将样品从 96 孔板移液到预先标记的试管中进行穿刺测定。使用预先稀释的 pierce 测定蛋白标准品，将 10 μL 每种标准品一式两份添加到 96 孔透明底板中。

然后将 10 μL 样品转移到板中。向所有含有标准品或样品的孔中加入 150 μL 穿刺试剂。盖上板，在摇板机上以中速混合 1 分钟。

将板在室温下孵育 5 分钟。将板插入读板器中，并选择波长设置为 660 纳米的吸光度终点测定。测量标准品和样品的吸光度，保存结果并绘制标准曲线以确定每个样品中的总微克级蛋白质。

葡萄糖荧光测量显示，孵育 30 分钟后，野生型小鼠视网膜中 6-NBDG 摄取增加，在 60 分钟时达到峰值，然后在 90 分钟后任意单位减少。添加 GLUT1 抑制剂 bay 876 后，6-NBDG 摄取减少了 24%，表明 GLUT1 非依赖性机制参与野生型小鼠视网膜。