当研究室では、加齢に伴う網膜や中枢神経系全体の代謝変化や神経変性疾患について研究しています。私たちの最優先の目標は、これらの知見を活用して、加齢に伴う神経変性疾患を治療するための新しい治療標的を特定することです。網膜組織におけるグルコースの取り込みを検出するには、多くの場合、費用と時間がかかり、複雑なイメージングモダリティや放射性物質が必要です。
私たちは、網膜サンプル中の蛍光グルコースアナログ取り込みを測定するための新しいex vivo技術を提供するために、このプロトコルを確立しました。私たちが開発したプロトコルは、蛍光グルコース類似体のex vivo取り込みを無傷の網膜全体まで測定するための簡単で費用対効果の高い戦略を提供します。この方法は、研究者が複数のサンプルを同時に測定できるため、利点もあります。
このプロトコルにより、研究者は蛍光グルコース類似体の網膜取り込みの変化を評価することができ、網膜が年齢とともに、また健康状態や病気の状態でも、グルコースをエネルギー基質としてどのように利用するかをよりよく理解するのに役立ちます。まず、50%DMSOとPBSの混合物に5ミリモルの6-NBDGのストック溶液を調製します。500マイクロリットルの溶液をマイナス20°Cで保存します。
ブドウ糖を含まないNeurobasal-A培地が入った50ミリリットルの円錐管を氷の上に置きます。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブをグルコース飢餓、6-NBDGインキュベーション、超音波処理、およびピアスアッセイ用のサンプル収集として標識します。冷やしたNeurobasal-A Mediumを100マイクロリットルを氷上の標識済み超音波処理チューブに加えます。.
プレートリーダーの電源を入れます。蛍光エンドポイントアッセイ機能を使用して、プレートリーダーソフトウェアでプレートパラメータを設定し、励起を483ナノメートル、発光を550ナノメートル、カットオフを530ナノメートルに設定します。Neurobasal-A培地で6つのNBDGの5ミリモルストック溶液を希釈して500マイクロモルの作業溶液を調製し、それをアルミホイルで覆って光から保護します。
200マイクロリットルの作業溶液を、あらかじめ標識された6-NBDGインキュベーションチューブにピペットで移し、示されているようにカバーします。トリミングされた転写ピペットまたはピンセットを使用して安楽死させたマウスから網膜を分離した後、グルコース飢餓のために200マイクロリットルのNeurobasal-A培地を含む1.5ミリリットルのチューブに網膜を移します。チューブを摂氏37度の水浴で20分間インキュベートします。
網膜を、Neurobasal-A Mediumに200マイクロリットルの500マイクロモル6-NBDGが入った標識済みチューブに移します。チューブを摂氏37度の水浴中で60分間インキュベートします。6-NBDG標準試料を調製するには、8本の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを標準物質1〜8として標識します。
標準的なものについては、500マイクロモルの6-NBDGストック溶液の32マイクロリットルをラベル付きチューブにピペットで移します。次に、368マイクロリットルのNeurobasal-A Mediumをチューブに加え、ピペッティングで上下に完全に混合します。すべてのチューブをアルミホイルで覆います。
60分間の6-NBDGインキュベーション後、37°Cのウォーターバスからチューブを取り出します。網膜を洗浄するには、網膜組織を乱さずにピペットを使用して6-NBDG溶液を取り出し、氷の上に500マイクロリットルの新鮮な氷で冷たかったNeurobasal-A培地を追加します。.次に、鉗子を使用して、網膜を氷上のNeurobasal-A培地を含む超音波処理チューブに慎重に移します。
小さな解剖ハサミを使用して、網膜を細かく刻みます。各網膜を10の振幅で5〜10秒間超音波処理し、すぐにチューブを氷の上に戻します。サンプルを21、130Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。
100マイクロリットルの上清を96ウェルプレートに移します。プレートをプレートリーダーに挿入します。指定した波長の蛍光エンドポイントアッセイを選択します。
アッセイを実行し、結果を保存します。分析後、96ウェルプレートからサンプルをピペットで固定したチューブにピペットで入れ、ピアスアッセイを行います。あらかじめ希釈したPierce Assayタンパク質スタンダードを使用して、各スタンダード10マイクロリットルを96ウェルクリアボトムプレートに2回ずつ加えます。
次に、10マイクロリットルのサンプルをプレートに移します。150マイクロリットルのピアス試薬を、標準品またはサンプルを含むすべてのウェルに添加します。プレートに蓋をし、プレートシェーカーで中速で1分間混合します。
プレートを室温で5分間インキュベートします。プレートをプレートリーダーに挿入し、波長が660ナノメートルに設定された吸光度エンドポイントアッセイを選択します。標準試料とサンプルの吸光度を測定し、結果を保存して標準曲線をプロットし、各サンプル中の総マイクログラムタンパク質を決定します。
グルコース蛍光測定では、野生型マウス網膜における6-NBDGの取り込みが30分インキュベーション後に増加し、60分でピークに達し、続いて90分後に任意の単位が減少することが示されました。GLUT1阻害剤であるベイ876の添加により、6-NBDGの取り込みが24%減少し、野生型マウス網膜にGLUT1非依存性メカニズムが関与していることが示されました。
