המעבדה שלנו חוקרת שינויים מטבוליים ברשתית ובכל מערכת העצבים המרכזית המתרחשים עם הגיל כמו גם במחלות ניווניות. מטרת העל שלנו היא למנף את הממצאים הללו כדי לזהות מטרות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות ניווניות הקשורות לגיל. זיהוי ספיגת גלוקוז ברקמת הרשתית הוא לרוב יקר וגוזל זמן, ודורש שיטות הדמיה מסובכות או אפילו חומרים רדיואקטיביים.
הקמנו פרוטוקול זה כדי לספק טכניקה חדשה ex vivo למדידת ספיגה אנלוגית של גלוקוז פלואורסצנטי בדגימות רשתית. הפרוטוקול שפיתחנו מספק אסטרטגיה פשוטה וחסכונית למדידת ספיגה מחוץ לגוף של אנלוגים של גלוקוז פלואורסצנטי לתוך רשתית שלמה ושלמה. שיטה זו היא גם יתרון מכיוון שהיא מאפשרת לחוקרים למדוד מספר דגימות בו זמנית.
פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים להעריך שינויים בספיגת הרשתית של אנלוגים פלואורסצנטיים של גלוקוז, מה שיעזור לנו להבין טוב יותר כיצד הרשתית מנצלת גלוקוז כמצע אנרגטי הן עם הגיל והן במצבי בריאות וחולי. כדי להתחיל, הכינו תמיסת מלאי של חמישה מילי-מולרי 6-NBDG בתערובת של 50% DMSO ו-PBS. אחסן 500 מיקרוליטר של התמיסה במינוס 20 מעלות צלזיוס.
הנח צינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל Neurobasal-A Medium ללא גלוקוז על קרח. סמן צינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר כהרעבת גלוקוז, דגירה של 6-NBDG, סוניקציה ואיסוף דגימות לבדיקת הפירס. הוסף 100 מיקרוליטר של Neurobasal-A Medium צונן לצינורות הסוניקציה המסומנים מראש על הקרח.
הפעל את קורא הצלחות. הגדר פרמטרי צלחת בתוכנת קורא הלוחות באמצעות תכונת בדיקת נקודת הקצה הקרינה עם עירור מוגדר ל-483 ננומטר, פליטה מוגדרת ל-550 ננומטר וניתוק מוגדר ל-530 ננומטר. לדלל את תמיסת המלאי של חמישה מילי-מולרים של שישה NBDG ב-Neurobasal-A Media כדי להכין תמיסת עבודה של 500 מיקרו-מולרית ולכסות אותה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור.
פיפטה 200 מיקרוליטר של תמיסת העבודה לתוך צינורות הדגירה 6-NBDG המסומנים מראש ומכסה כפי שהודגם. לאחר בידוד הרשתית מעכבר שעבר המתת חסד באמצעות פיפטה או פינצטה קצוצה, העבירו את הרשתית לצינור של 1.5 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר של מדיום נוירו-בזאלי-A להרעבת גלוקוז. דגרו את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
העבירו את הרשתית לצינור מסומן מראש המכיל 200 מיקרוליטר של 500 מיקרו-מולרי 6-NBDG במדיום נוירו-בסיסי. דגרו את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. כדי להכין תקני 6-NBDG, סמן שמונה צינורות מיקרו צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר כתקנים אחד עד שמונה.
עבור תקן אחד, פיפטה 32 מיקרוליטר של תמיסת מלאי 500 מיקרומולרית 6-NBDG לתוך הצינור המסומן. לאחר מכן הוסף 368 מיקרוליטר של Neurobasal-A Medium לצינור וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. מכסים את כל הצינורות בנייר אלומיניום.
לאחר הדגירה של 60 דקות 6-NBDG, הסר את הצינורות מאמבט המים של 37 מעלות צלזיוס. כדי לשטוף את הרשתית, הסר את תמיסת 6-NBDG באמצעות פיפטה מבלי להפריע לרקמת הרשתית והוסף 500 מיקרוליטר קר קרח טרי Neurobasal-A Medium על קרח. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, העבירו בזהירות את הרשתית לצינורות הסוניקציה המכילים Neurobasal-A Medium על קרח.
בעזרת מספריים לדיסקציה קטנה, קוצצים את הרשתית לחתיכות קטנות. סוניקציה של כל רשתית למשך חמש עד 10 שניות במשרעת של 10, ומיד הנח את הצינור בחזרה על הקרח. צנטריפוגה את הדגימות ב-21, 130 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מעבירים 100 מיקרוליטר של סופרנטנט לצלחת של 96 בארות. הכנס את הצלחת לקורא הצלחות. בחר את מבחן נקודת הקצה הקרינה עם אורכי גל שצוינו.
הפעל את הבדיקה ושמור את התוצאות. לאחר הריצה, פיפטה את הדגימות מצלחת 96 הבארות לצינורות מסומנים מראש לבדיקת הפירס. באמצעות תקני חלבון בדיקת הפירס המדולל מראש, הוסף 10 מיקרוליטר מכל תקן בשכפול לצלחת תחתונה שקופה של 96 בארות.
ואז העבירו 10 מיקרוליטר דגימה לצלחת. הוסף 150 מיקרוליטר של מגיב פירס לכל הבארות המכילות תקנים או דגימות. מכסים את הצלחת ומערבבים על שייקר צלחת במהירות בינונית למשך דקה.
דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הכנס את הצלחת לקורא הלוחות ובחר את מבחן נקודת הקצה של הספיגה עם אורך גל המוגדר ל-660 ננומטר. מדוד את הספיגה של התקנים והדגימות, שמור את התוצאות והתווה עקומה סטנדרטית כדי לקבוע את חלבון המיקרוגרם הכולל בכל דגימה.
מדידות פלואורסצנטיות של גלוקוז הראו עלייה בספיגת 6-NBDG ברשתית עכברים מסוג בר לאחר 30 דקות של דגירה, שהגיעה לשיא ב-60 דקות, ואחריה ירידה ביחידות שרירותיות לאחר 90 דקות. התוספת של מעכב GLUT1, מפרץ 876, הפחיתה את ספיגת 6-NBDG ב-24%, מה שמצביע על מעורבות של מנגנונים בלתי תלויים ב-GLUT1 ברשתית העכבר מסוג הבר.
