Nuestro laboratorio investiga los cambios metabólicos en la retina y en todo el sistema nervioso central que ocurren con la edad, así como en las enfermedades neurodegenerativas. Nuestro objetivo primordial es aprovechar estos hallazgos para identificar nuevas dianas terapéuticas para tratar las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad. La detección de la absorción de glucosa en el tejido de la retina suele ser costosa y requiere mucho tiempo, ya que requiere complicadas técnicas de imagen o incluso sustancias radiactivas.
Establecimos este protocolo para proporcionar una nueva técnica ex vivo para medir la absorción de análogos de glucosa fluorescente en muestras de retina. El protocolo que hemos desarrollado proporciona una estrategia sencilla y rentable para medir la absorción ex vivo de análogos de glucosa fluorescente en una retina intacta completa. Este método también es ventajoso, ya que permite a los investigadores medir varias muestras simultáneamente.
Este protocolo permitirá a los investigadores evaluar los cambios en la absorción de análogos fluorescentes de glucosa en la retina, lo que nos ayudará a comprender mejor cómo la retina utiliza la glucosa como sustrato energético tanto con la edad como en estados saludables y enfermos. Para comenzar, prepare una solución madre de 5 milimolares de 6-NBDG en una mezcla de 50% DMSO y PBS. Almacene 500 alícuotas de microlitros de la solución a menos 20 grados centígrados.
Coloque un tubo cónico de 50 mililitros que contenga medio Neurobasal-A sin glucosa en hielo. Etiquete los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros como inanición de glucosa, incubación de 6-NBDG, sonicación y recogida de muestras para el ensayo de perforación. Añadir 100 microlitros de medio Neurobasal-A refrigerado a los tubos de sonicación premarcados en hielo.
Encienda el lector de placas. Configure los parámetros de la placa en el software del lector de placas mediante la función de ensayo de punto final de fluorescencia con la excitación establecida en 483 nanómetros, la emisión establecida en 550 nanómetros y el corte establecido en 530 nanómetros. Diluya la solución madre de cinco milimolares de seis NBDG en medios Neurobasal-A para preparar una solución de trabajo de 500 micromolares y cúbrala con papel de aluminio para protegerla de la luz.
Pipetee 200 microlitros de la solución de trabajo en los tubos de incubación 6-NBDG preetiquetados y cúbralos como se muestra. Después de aislar la retina de un ratón sacrificado con una pipeta de transferencia recortada o pinzas, transfiera la retina a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de medio Neurobasal-A para la inanición de glucosa. Incuba el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos.
Transfiera la retina a un tubo premarcado que contenga 200 microlitros de 6-NBDG de 500 micromolares en medio Neurobasal-A. Incuba el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 60 minutos. Para preparar los estándares 6-NBDG, etiquete ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros como estándares del uno al ocho.
Para uno estándar, pipetee 32 microlitros de solución madre de 6-NBDG de 500 micromolares en el tubo etiquetado. A continuación, añada 368 microlitros de medio Neurobasal-A al tubo y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Cubra todos los tubos con papel de aluminio.
Después de la incubación de 60 minutos con 6-NBDG, retire los tubos del baño de agua a 37 grados centígrados. Para lavar la retina, retire la solución de 6-NBDG con una pipeta sin alterar el tejido de la retina y agregue 500 microlitros de Neurobasal-A Medium fresco y helado sobre hielo. A continuación, con unas pinzas, transfiera cuidadosamente la retina a los tubos de sonicación que contienen Neurobasal-A Medium en hielo.
Con unas tijeras de disección pequeñas, corta la retina en pedazos pequeños. Sonicar cada retina durante cinco a 10 segundos a una amplitud de 10, e inmediatamente volver a colocar el tubo en hielo. Centrifugar las muestras a 21,130 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Transfiera 100 microlitros de sobrenadante a una placa de 96 pocillos. Inserte la placa en el lector de placas. Seleccione el ensayo de punto final de fluorescencia con longitudes de onda especificadas.
Ejecute el ensayo y guarde los resultados. Después de la ejecución, pipetee las muestras de la placa de 96 pocillos en tubos preetiquetados para el ensayo de perforación. Usando los patrones de proteínas de ensayo perforado prediluidos, agregue 10 microlitros de cada patrón por duplicado en una placa inferior transparente de 96 pocillos.
A continuación, transfiera 10 microlitros de muestra a la placa. Agregue 150 microlitros de reactivo de perforación a todos los pocillos que contengan patrones o muestras. Cubra el plato y mezcle en un agitador de platos a velocidad media durante un minuto.
Incuba la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos. Inserte la placa en el lector de placas y seleccione el ensayo de punto final de absorbancia con una longitud de onda establecida en 660 nanómetros. Mida la absorbancia de los patrones y las muestras, guarde los resultados y trace una curva estándar para determinar la proteína total en microgramos en cada muestra.
Las mediciones de fluorescencia de glucosa mostraron un aumento en la absorción de 6-NBDG en la retina de ratón de tipo salvaje después de 30 minutos de incubación, alcanzando un máximo de 60 minutos, seguido de una disminución en unidades arbitrarias después de 90 minutos. La adición del inhibidor de GLUT1, bahía 876, redujo la absorción de 6-NBDG en un 24%, lo que indica la participación de mecanismos independientes de GLUT1 en la retina de ratón de tipo salvaje.
