Laboratuvarımız, yaşla birlikte ve nörodejeneratif hastalıklarda ortaya çıkan retina ve merkezi sinir sistemi boyunca metabolik değişiklikleri araştırır. En önemli hedefimiz, yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için yeni terapötik hedefler belirlemek için bu bulgulardan yararlanmaktır. Retina dokusunda glukoz alımını tespit etmek genellikle pahalı ve zaman alıcıdır, karmaşık görüntüleme yöntemleri ve hatta radyoaktif maddeler gerektirir.
Bu protokolü, retina örneklerinde floresan glukoz analog alımını ölçmek için yeni bir ex vivo teknik sağlamak için oluşturduk. Geliştirdiğimiz protokol, floresan glukoz analoglarının tüm sağlam retinaya ex vivo alımını ölçmek için basit ve uygun maliyetli bir strateji sağlar. Bu yöntem, araştırmacıların aynı anda birden fazla numuneyi ölçmesine izin verdiği için de avantajlıdır.
Bu protokol, araştırmacıların floresan glikoz analoglarının retina alımındaki değişiklikleri değerlendirmelerini sağlayacak ve bu da retinanın hem yaşla birlikte hem de sağlıklı ve hastalık durumlarında enerjik bir substrat olarak glikozu nasıl kullandığını daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Başlamak için,% 50 DMSO ve PBS karışımı içinde beş milimolar 6-NBDG'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Çözeltinin 500 mikrolitrelik alikotunu eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Glikoz içermeyen Neurobazal-A Ortamı içeren 50 mililitrelik konik bir tüpü buz üzerine yerleştirin. 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerini glikoz açlığı, 6-NBDG inkübasyonu, sonikasyon ve delme testi için numune toplama olarak etiketleyin. Buz üzerinde önceden etiketlenmiş sonikasyon tüplerine 100 mikrolitre soğutulmuş Neurobazal-A Medium ekleyin.
Plaka okuyucuyu açın. Uyarma 483 nanometreye, emisyon 550 nanometreye ve kesme değeri 530 nanometreye ayarlanmış floresan son nokta testi özelliğini kullanarak plaka okuyucu yazılımında plaka parametrelerini ayarlayın. 500 mikromolar çalışma solüsyonu hazırlamak için altı NBDG'nin beş milimolar stok solüsyonunu Neurobazal-A Ortamında seyreltin ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın.
200 mikrolitre çalışma solüsyonunu önceden etiketlenmiş 6-NBDG inkübasyon tüplerine pipetleyin ve gösterildiği gibi kapatın. Kesilmiş bir transfer pipeti veya cımbız kullanarak retinayı ötenazi yapılmış bir fareden izole ettikten sonra, retinayı glikoz açlığı için 200 mikrolitre Neurobazal-A Ortamı içeren 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü 37 santigrat derece su banyosunda 20 dakika inkübe edin.
Retinayı, Neurobazal-A Ortamında 200 mikrolitre 500 mikromolar 6-NBDG içeren önceden etiketlenmiş bir tüpe aktarın. Tüpü 37 santigrat derece su banyosunda 60 dakika inkübe edin. 6-NBDG standartlarını hazırlamak için, sekiz adet 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü bir ila sekiz standart olarak etiketleyin.
Standart olanı için, 32 mikrolitre 500 mikromolar 6-NBDG stok çözeltisini etiketli tüpe pipetleyin. Daha sonra tüpe 368 mikrolitre Neurobazal-A Medium ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Tüm tüpleri alüminyum folyo ile kaplayın.
60 dakikalık 6-NBDG inkübasyonundan sonra, tüpleri 37 santigrat derece su banyosundan çıkarın. Retinayı yıkamak için, retina dokusunu rahatsız etmeden bir pipet kullanarak 6-NBDG solüsyonunu çıkarın ve buz üzerine 500 mikrolitre taze buz gibi soğuk Neurobazal-A Medium ekleyin. Daha sonra, forseps kullanarak, retinayı buz üzerinde Neurobazal-A Medium içeren sonikasyon tüplerine dikkatlice aktarın.
Küçük diseksiyon makası kullanarak retinayı küçük parçalar halinde doğrayın. Her retinayı 10 genlikte beş ila 10 saniye boyunca sonikleştirin ve tüpü hemen tekrar buzun üzerine yerleştirin. Numuneleri 21, 130 G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.
100 mikrolitre süpernatanı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. Belirtilen dalga boylarına sahip floresan son nokta testini seçin.
Testi çalıştırın ve sonuçları kaydedin. Çalıştırmadan sonra, numuneleri 96 oyuklu plakadan delme testi için önceden etiketlenmiş tüplere pipetleyin. Önceden seyreltilmiş delme testi protein standartlarını kullanarak, her standarttan 10 mikrolitreyi iki kez 96 oyuklu şeffaf bir alt plakaya ekleyin.
Daha sonra 10 mikrolitre numuneyi plakaya aktarın. Standartlar veya numuneler içeren tüm kuyucuklara 150 mikrolitre delme reaktifi ekleyin. Plakayı örtün ve bir dakika boyunca orta hızda bir plaka çalkalayıcı üzerinde karıştırın.
Plakayı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve dalga boyu 660 nanometreye ayarlanmış bir absorbans son nokta testini seçin. Standartların ve numunelerin absorbansını ölçün, sonuçları kaydedin ve her numunedeki toplam mikrogram proteini belirlemek için standart bir eğri çizin.
Glikoz floresan ölçümleri, 30 dakikalık inkübasyondan sonra vahşi tip fare retinasında 6-NBDG alımında bir artış gösterdi, 60 dakikada zirve yaptı, ardından 90 dakika sonra keyfi birimlerde bir azalma oldu. GLUT1 inhibitörü, bay 876'nın eklenmesi, 6-NBDG alımını %24 oranında azalttı, bu da vahşi tip fare retinasında GLUT1 bağımsız mekanizmalarının katılımını gösterir.
