Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Zusammenfassung

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Zusammenfassung

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Einleitung

Sequenzierung und Genotypisierung basierte Studien, einschließlich der genomweiten Assoziationsstudien (GWAS), Kandidaten-Locus Studien und tiefSequenzierungsUntersuchungen haben viele genetische Varianten identifiziert, die statistisch im Zusammenhang mit einer Krankheit, Zug oder Phänotyp. Im Gegensatz zu dem frühen Vorhersagen, die meisten dieser Varianten (85-93%) werden in nicht-codierenden Regionen und die Aminosäuresequenz von Proteinen nicht ^1,2 ändern. Interpretieren der Funktion dieser nicht-kodierenden Varianten und Bestimmung der biologischen Mechanismen , um sie zu dem zugeordneten Krankheit verbindet, trait oder Phänotyp hat Herausforderung erwiesen ^3-6. Wir haben eine allgemeine Strategie entwickelt, um die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die Varianten zu einem wichtigen Zwischen Phänotyp verknüpfen - Genexpression. Diese Pipeline wird speziell zu identifizieren, die Modulation der TF-Bindung durch genetische Varianten entwickelt. Diese Strategie kombiniert Rechenansätze und Techniken der Molekularbiologie Ziel vorherzusagenbiologische Wirkungen von Kandidatenvarianten in silico, und überprüfen diese Prognosen empirisch (Abbildung 1).

Abbildung 1:.. Strategischer Ansatz für die Analyse von nicht-kodierenden genetischen Varianten Schritte, die in der detaillierten Protokoll sind nicht mit diesem Manuskript assoziiert enthalten sind grau schattiert Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

In vielen Fällen ist es wichtig, durch eine Erweiterung der Liste der Varianten zu beginnen alle, die in hohen Gestänge-Ungleichgewichts (LD) mit jeder statistisch assoziiert Variante enthalten. LD ist ein Maß der nicht-zufällige Assoziation von Allelen an zwei verschiedenen chromosomalen Stellen, die durch die r ² -Statistik ⁷ gemessen werden kann. r ² ist ein Maß für die linKage Ungleichgewichts zwischen zwei Varianten, mit einem r ² = 1 bezeichnet perfekte Verbindung zwischen zwei Varianten. Allelen in hohen LD gefunden auf dem Chromosom über Vorfahren Populationen zusammen entmischen. Aktuelle Genotypisierung Arrays enthalten nicht alle bekannten Varianten im menschlichen Genom. Stattdessen verwerten sie die LD innerhalb des menschlichen Genoms und sind eine Teilmenge der bekannten Varianten , die ⁸ für andere Varianten innerhalb einer bestimmten Region des LD als Stellvertreter fungieren. Somit kann mit einer bestimmten Krankheit assoziiert sein eine Variante ohne biologische Folge kann, da es in LD mit dem kausalen varianten der Variante mit einer sinnvollen biologischen Wirkung. Prozedural, wird empfohlen , die neueste Version der 1000 Genome Projekt ⁹ Variante Call - Dateien (VCF) in binäre Dateien zu konvertieren kompatibel mit PLINK ^10,11, einem Open-Source - Tool für Genom - Assoziations - Analyse. Anschließend werden alle anderen genetischen Varianten mit LD r ^2> 0,8 mit jedem Eingang genetischen variant als Kandidaten identifiziert werden. Es ist wichtig , die entsprechende Referenzpopulation für diese Schritt- zB zu verwenden, wenn eine Variante , bei Themen von europäischer Abstammung identifiziert wurde, Daten von Patienten mit ähnlicher Herkunft sollte für LD Expansion verwendet werden.

LD Expansion resultiert oft in Dutzenden von Kandidatenvarianten, und es ist wahrscheinlich, dass nur ein kleiner Bruchteil von diesen zu Krankheitsmechanismus beizutragen. Oft ist es nicht durchführbar, experimentell jede dieser Varianten einzeln untersuchen. Es ist daher sinnvoll, die Tausende von öffentlich verfügbaren funktionellen genomischen Datensätze als Filter zu nutzen, um die Varianten zu priorisieren. Zum Beispiel ¹² das ENCODE - Konsortium hat Tausende von ChIP-seq Experimente beschreiben die Bindung von Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren, und Histonmarkierungen in einem breiten Spektrum von Kontexten, zusammen mit Chromatin Zugänglichkeit von Daten von Technologien wie DNase-seq ^13, ATAC ausgeführt -SEQ ¹⁴ und FAIRE-seq ^15. DatabAses und Web - Servern wie dem UCSC Genome Browser ^16, Roadmap Epigenomics ^17, Epigenome Blueprint ^18, Cistrome ¹⁹ und ReMap ²⁰ bieten freien Zugang zu Daten , die durch diese und andere experimentelle Techniken in einer Vielzahl von Zelltypen und Bedingungen hergestellt. Wenn es zu viele Varianten sind experimentell zu untersuchen, können diese Daten verwendet werden, die innerhalb wahrscheinlich regulatorischen Regionen in entsprechenden Zell- und Gewebetypen angeordnet zu priorisieren. Ferner wird in Fällen, in denen eine Variante für ein spezifisches Protein in einer ChIP-seq peak ist, können diese Daten Potential führt als der spezifischen TF (s) oder Cofaktoren schaffen, deren Bindung könnte beeinflussen.

Als nächstes werden die resultierenden priorisiert Varianten gescreent experimentell vorhergesagt Genotyp-abhängige Protein zu validieren Bindungs ^​​21,22 mittels EMSA. EMSA misst die Veränderung in der Migration des oligo auf einem nicht-reduzierenden TBE-Gel. Fluoreszierend markiertes Oligo mit der inkubiertenKern Lysat, und die Bindung von Kernfaktoren wird verzögern die Bewegung des Oligo auf dem Gel. Auf diese Weise Oligo, die mehr Kernfaktoren gebunden hat, als ein stärkeres Fluoreszenzsignal beim Abtasten präsentieren wird. Bemerkenswert ist, erfordert keine EMSA Prognosen über die spezifischen Proteine, deren Bindung betroffen.

Sobald Varianten identifiziert werden, die innerhalb der erwarteten regulatorischen Regionen befinden und in der Lage sind unterschiedlich Bindung Kernfaktoren sind Berechnungsverfahren die spezifische TF (s), dessen vorherzusagen verwendet Bindung sie beeinflussen könnten. Wir bevorzugen CIS-BP ^23,24, RegulomeDB ^25, UNIProbe ²⁶ zu verwenden, und JASPAR ^27. Sobald Kandidaten TFs identifiziert werden, können diese Prognosen ausdrücklich Antikörper gegen diese TFs (EMSA-supershifts und DAPA-Westerns) getestet werden. Eine EMSA-Supershift beinhaltet die Zugabe eines TF-spezifischen Antikörpers an das Kern Lysat und Oligo. Ein positives Ergebnis in einem EMSA-Supershift ist represented als eine weitere Verschiebung der EMSA Band oder einem Verlust des Bandes (in Bezug ²⁸ überprüft). In der komplementären DAPA, eine 5'-biotinylierten Oligokomplexes die Variante und das 20 Basenpaar-flankierenden Nukleotide enthalten, werden mit nuklearen Lysat von relevanten Zelltyp (en) inkubiert alle Kernfaktoren speziell zur Erfassung der Oligos binden. Die Oligokomplexes-nuclear factor-Komplex wird durch Streptavidin-Mikrokügelchen in einer magnetischen Säule immobilisiert. Die gebundenen Kernfaktoren werden direkt durch Elution ^29,48 gesammelt. Bindungsvorhersagen können dann durch Western-Blot untersucht werden, um Antikörper, spezifisch für das Protein verwendet wird. In Fällen, in denen es keine offensichtlichen Prognosen oder zu viele Vorhersagen, die Elutionen von Variante Pull-downs der DAPA Experimente können zu einem Proteomik Kern gesendet werden, um Kandidaten TFs mit Massenspektrometrie identifizieren, die anschließend validiert werden können mit diesen zuvor beschriebenen Methoden.

In dem Rest des article wird das detaillierte Protokoll für EMSA und DAPA Analyse genetischer Varianten vorgesehen.

Protokoll

1. Herstellung von Lösungen und Reagenzien

1. Bestellen Sie kundenspezifische DNA-Oligonukleotid-Sonden zur Verwendung in EMSA und DAPA.
   1. Zur Reduzierung der unspezifischen Proteinbindung, entwerfen kurze Oligos (zwischen 35-45 Basenpaare (bp) in der Länge) ^30, und legen Sie die Variante von Interesse direkt in der Mitte , flankiert von seinen 17 bp endogene genomische Sequenz. Für EMSA Oligos, eine 5'-Fluorophor hinzuzufügen. Für DAPA Oligos, eine 5'-Biotin-Tag hinzufügen.
   2. Um sowohl die Sense-Strang und seine Umkehrkomplement Strang. Alternativ bestellen Duplex (vorgeglüht) Oligos. Wenn die Oligos zu benennen, stellen Sie die Nomenklatur, die auf einem festgelegten Referenzgenom.
      Hinweis: "Risiko" und "Nicht-Risiko" -Bezeichnung können Krankheit und projektspezifische, während "Referenz" und "non-reference" sind universell relevant sein.
   3. Bei der Ankunft der Oligos, drehen kurz den Inhalt nach unten und resuspendieren in Nuklease-freies Wasser bis zu einer endgültigen Konzentration von 100 μ; M. Shop suspendiert Lager bei -20 ° C. Schützen Oligos mit einem Fluorophor aus Licht markiert, indem sie mit Alufolie wickeln.

Name	Sequenz
rs76562819_REF_FOR	GTAATGCCTTAATGAGAGAG A GTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_REF_REV	GAAGTGAGAAGATGACTAAC T CTCTCTCATTAAGGCATTAC
rs76562819_NONREF_FOR	GTAATGCCTTAATGAGAGAG G GTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_NONREF_REV	GAAGTGAGAAGATGACTAAC C CTCTCTCATTAAGGCATTAC

Tabelle 1: Beispiel EMSA / DAPA Oligonukleotid - Entwurf , der eine SNP für Differential bin zu testending. "REF" steht für die Referenz - Allels, während "NONREF" für die Nicht-Referenz - Allels steht. "FOR" steht für den vorderen Strang, während "REV" sein Komplement an. Die SNP wird in rot gesehen.

2. Vorbereitung zytoplasmatischen Extraktion (CE) Puffer mit einer Endkonzentration von 10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl und 0,1 mM EDTA in deionisiertem Wasser.
3. Vorbereitung Kernextraktion (NE) Puffer mit einer Endkonzentration von 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,4 M NaCl und 1 mM EDTA in deionisiertem Wasser.
4. Vorbereitung Anelierungspuffer mit einer Endkonzentration von 10 mM Tris (pH 7,5-8,0), 50 mM NaCl und 1 mM EDTA in deionisiertem Wasser.

2. Herstellung von Kern Lysate aus kultivierten Zellen

Hinweis: Dieses experimentelle Protokoll wurde optimiert B-lymphoblastoiden Zelllinien, hat aber in mehreren anderen unabhängigen adhärenten / Suspensions-Zelllinien und arbeitet universell getestet.

1. Culture B-lymphoblastoiden Zellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mit 2 mM L-Glutamin, 10% fötalem Rinderserum und 1x Antibiotikum-Antimykotikum, enthaltend 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 250 ng / ml Amphotericin B.
   1. Seed in einem Bereich von 200.000-500.000 lebenden Zellen / ml und Inkubation Kolben bei 37 ° C mit 5% Kohlendioxid in einer aufrechten Position mit belüfteten oder lose Kappen.
      Hinweis: Das Wachstum der B-lymphoblastoiden Zellen verlangsamt, wenn sie über 1.000.000 Zellen / ml erreichen. Break up-Zell-Blasten durch Auf- und Abpipettieren mehrmals und das Rück Zellen zu 200.000-500.000 Zellen / ml eine schnelle Wachstumsrate aufrecht zu erhalten.
2. Zweimal waschen kultivierten Zellen mit 10 ml eiskaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), Spin-down bei 4 ° C, 300 g für 5 min und entfernen PBS durch Absaugen.
3. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und Pellet als 1 ml eiskaltem PBS pro 10 ⁷ Zellen.
   Hinweis: Wenn beispielsweise Lysieren von 2 x 10 ^{7 <}/ Sup> Zellen, Resuspendieren in 2 ml PBS.
4. Aliquot 1 ml bis 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen so daß jedes Rohr 10 ⁷ Zellen in PBS enthält. Zentrifuge bei 3.300 × g für 2 min 4 ° C und absaugen PBS.
5. Vor der Verwendung hinzufügen 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1x Phosphatase-Inhibitor und 1x Protease-Inhibitor zu einem Arbeits Lager von CE-Puffer. Resuspendieren Zellpellet mit 400 ul CE-Puffer und Inkubation für 15 Minuten auf Eis.
6. In 25 ul 10% Nonidet P-40 und mischen durch Pipettieren. Zentrifuge bei 4 ° C, max Geschwindigkeit für 3 min. Dekantieren und den Überstand verwerfen.
7. Vor der Verwendung hinzufügen 1 mM DTT, 1x Phosphatase-Inhibitor und 1x Protease-Inhibitor zu einem Arbeits Lager von NE-Puffer. Resuspendieren Zellpellet mit 30 ul Puffer NE und durch Vortexen mischen.
8. Inkubieren bei 4 ° C in einem Rohr Rotator oder auf Eis für 10 min. Zentrifuge 3.300 xg für 2 min 4 ° C.
9. Sammeln Sie die klare Überstand (nuclear Lysat) und aliquoten vor der Lagerung bei -806; C mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden, die das Protein abbauen kann. Lassen Sie eine 10 - ul - Aliquot Proteinkonzentration unter Verwendung des bichoninic Säure - Assay (BCA) ³¹ zu messen.

3. elektrophoretische Mobilität Shift Assay (EMSA)

1. Bereiten Sie Oligo-Funktion Stock und EMSA Gel.
   1. Wenn Oligos im Duplex bestellt wurden, tauen die 100 uM Lager und verdünnt 1: 2000 in Anelierungspuffer 50 nM Arbeits Lager zu erreichen.
   2. Wenn Oligos wurden einsträngige bestellt, tauen die 100 uM Aktien und verdünnen 1:10 in Anelierungspuffer 100 nM Arbeitsvorräte zu erreichen. Kombinieren von 100 ul der 100 nM Komplement Strang Lösung miteinander in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
      1. In einem Heizblock bei 95 ° C für 5 min. Schalten Sie die Hitze Block aus und lassen Sie die Oligos langsam für mindestens eine Stunde auf Raumtemperatur abkühlen vor der Verwendung.
   3. die EMSA Gel Pre-run.
      1. Entfernen Sie die Folie aus einem vorgegossenen 6% TBE Gel und spülen Sie unter entsalztes Wasser mehrmals jeden Puffer aus den Vertiefungen zu entfernen. Vorbereitung 1 l TBE-Puffer 0,5x durch Zugabe von 50 ml 10x TBE zu 950 ml deionisiertem Wasser hergestellt.
      2. Montieren Sie das Gel Elektrophorese-Vorrichtung und auf Dichtigkeit prüfen durch die innere Kammer füllt mit 0,5x TBE-Puffer. Wenn kein Puffer in die äußere Kammer austritt, füllen die äußere Kammer etwa zwei Drittel des Weges.
      3. Pre-run für 60 Minuten das Gel bei 100 V.
      4. Spülen Sie jede Vertiefung mit 200 ul 0,5x TBE-Puffer.
2. Bereiten Sie Buffer Master Mix Bindung.
   1. Bereiten 10x Puffer mit einer Endkonzentration von 100 mM Tris-Bindungs, 500 mM KCl, 10 mM DTT; pH-Wert 7,5 in entmineralisiertem Wasser.
   2. In einem Mikrozentrifugenröhrchen, schaffen eine Mastermix der Reagenzien bestehend gemeinsam für alle Reaktionen (10 ul 10fach Bindungspuffer, 10 ul DTT / Polysorbat, 5 & mgr; l Poly d (IC), und 2,5 ul Lachssperma - DNA; Tabelle 2). Bereiten Sie eine zusätzliche 10%zur Volumenverlust durch Pipettieren zu berücksichtigen.

Reagens	Endkonz.	Rxn 1 #	Rxn 2 #	Rxn 3 #	Rxn 4 #
Reinstwassersysteme	bis 20 & mgr; l Vol.	13,5 ul	11.98 ul	13.5μl	11.98 ul
10x Binding Buffer	1x	2 ul	2 ul	2 ul	2 ul
DVB - T / TW-20	1x	2 ul	2 ul	2 ul	2 ul
Lachssperma - DNA	500 ng / ul	0,5 ul	0,5 ul	0,5 ul	0,5 ul
1 ug / ul Poly d (IC)	1 & mgr; g	1 ul	1 ul	1 ul	1 ul
Kernextrakt (5,26 ug / ul)	8 & mgr; g	-	1,52 ul	-	1,52 ul
NE - Puffer		1,52 ul	-	1,52 ul	-
Referenz - Allels Oligo	50 fmol	1 ul	1 ul	-	-
Nicht-Referenz - Allels Oligo	50 fmol	-	-	1 ul	1 ul

Tabelle 2: Beispiel EMSA Reaktion setup. Die Tabelle zeigt ein Beispiel EMSA die Hypothese zu testen , dass Genotyp-abhängig ist , die Bindung von TFs zu einem spezifischen SNP.

3. In Nuklease-freies Wasser in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, so dass das endgültige Volumen nach Zugabe aller Reagenzien 20 ul sein wird.
4. Fügen Sie den entsprechenden Betrag (5,5 ul) Master-Mix zu jedem Reaktionsgefäß.
5. In 8 ug Kern Lysat zu den entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie Röhren die Oligo ohne Kernextrakt als Negativkontrollen (zB Tabelle 2, Rxn # 1 und Rxn # 3) enthält.
   Anmerkung: Die optimale Menge an Lysat pro Reaktion experimentell durch Titration bestimmt werden. Im Allgemeinen wird ein Bereich von 2-10 & mgr; g Lysat Titrieren ausreichend.
6. In 50 fmol Oligo an die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen. Flick zu mischen und kurz den Inhalt auf den Boden der Röhre drehen. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Wenn attemptieinen Supershift ng, inkubiere für 20 min mit Antikörper bei Raumtemperatur vor der Zugabe von Oligos des Lysats Mischung. Es wird empfohlen, für die besten Ergebnisse 1 ug eines ChIP-Grade-Antikörper zu verwenden.
7. In 2 ul 10x orange Loading Dye zu jedem Reaktionsgefäß. Pipette nach oben und unten zu mischen.
8. Legen Sie die Proben in den Vorlauf 6% TBE-Gel durch Pipettieren nach oben und unten zu mischen und dann jede Probe in einem separaten gut vertreiben. Führen Sie das Gel bei 80 V bis die orange Farbstoff 2/3 bis 3/4 des Weges durch das Gel gewandert ist. Dies sollte etwa 60 bis 75 Minuten dauern.
9. Entfernen Sie das Gel aus dem Plastikkassette durch sie offen mit einem Gel Messer neugierigen und legen Sie das Gel in einen Behälter mit 0,5% TBE-Puffer, damit er nicht austrocknet.
10. Legen Sie das Gel auf der Oberfläche eines Infrarot und Chemilumineszenz-Bildgebungssystem, wobei Sie alle Blasen oder Verunreinigungen zu beseitigen, die das Bild stören wird.
11. Mit dem Scan-System-Software, klicken Sie auf den "Acquire" Registerkarteund dann wählen Sie "Neu Zeichnen", um ein Feld ziehen rund um den Bereich entsprechend, wo das Gel befindet sich auf der Oberfläche des Scanners.
12. In der "Kanäle" des "Acquire", wählen Sie den Kanal auf der Wellenlänge des Fluorophor-Markierung auf dem Oligo entspricht. In der "Scanner" Abschnitt, klicken Sie auf "Vorschau", um eine minderwertige Scan-Vorschau erhalten. Stellen Sie den Scanbereich durch das blaue Feld ziehen, das erworbene Vorschaubild bis auf den Teil des Gels umgebenden abgebildet werden.
    Hinweis: Wenn zum Beispiel Oligos, markiert mit einem 700 nm Fluorophore verwenden, stellen Sie sicher, dass die "700 nm" Kanal vor dem Scannen ausgewählt wird.
13. In der "Scan-Steuerungen" Abschnitt, wählen Sie die "84 & mgr; M" Auflösungsoption und das "Medium" Qualität Option. Setzen Sie den Fokus auf die Hälfte der Dicke des Gels zu kompensieren. Hinweis: Zum Beispiel kann ein 1 mm Gel mit einer 0,5 mm Fokusversatz verwenden würde.
14. In der "Scanner" Abschnitt, klicken Sie auf "Start" zu bEGIN den Scanvorgang.
    Hinweis: Während des Scans die Helligkeit, Kontrast und Farbschema oft manuell angepasst werden je nach Hersteller des Abtastsystems werden kann.
15. Nachdem die Prüfung abgeschlossen ist, wählen Sie die Registerkarte "Bild" und klicken Sie auf "Drehen oder Kippen" im Abschnitt "Create", um die Ausrichtung zu korrigieren. Speichern Sie die Bilddatei von "Export" im Hauptmenü klicken und dann auf "Einzelbildansicht."

4. DNA-Affinitätsreinigung Assay (DAPA)

1. Herstellung von 5 & mgr; M Oligo-Funktion Stock.
   1. Wenn Oligos im Duplex bestellt wurden, tauen die 100 uM Lager und verdünnen 01.20 in Anelierungspuffer 5 uM Arbeits Lager zu erreichen.
   2. Wenn Oligos wurden einsträngige bestellt, tauen die 100 uM Aktien und verdünnen 1:10 in Anelierungspuffer 10 uM Arbeitsvorräte zu erreichen. Mähdrescher 10 & mgr; l der 10 & mgr; M komplementäre Stränge miteinander. In einem Heizblock bei 95 ° C für5 Minuten. Schalten Sie die Hitze Block aus und lassen Sie die Oligos langsam auf Raumtemperatur abkühlen vor der Verwendung.
2. Vor dem Start aufzuwärmen Bindungspuffer, niedriger Stringenz-Waschpuffer, hochstringenten Waschpuffer und Elutionspuffer auf Raumtemperatur.
   Hinweis: eine Endkonzentration von 50 ng / ml Poly d (IC) mit dem Bindungspuffer, niedriger Stringenz-Waschpuffer hinzugefügt und hoher Stringenz-Waschpuffer potentielle nicht-spezifische Bindung von Proteinen an die Oligos zu reduzieren.
3. Bereiten Sie die Bindung Mischungen für jede Variante.
   1. 1 Volumenteil der Kern Lysat mit 2 Volumina Bindungspuffer.
      Anmerkung: Die erforderliche Menge an Lysat muss experimentell bestimmt werden aufgrund unterschiedlicher Fülle von TFs. zwischen 100-250 ug Kern Lysat pro Spalte ist in den meisten Fällen ausreichend.
   2. In 1x Phosphatase-Inhibitor, 1x Proteaseinhibitor und 1x Bindungsverstärker (optional) und mischen durch das Rohr mehrmals schnippen.
      Hinweis: 100x BindungEnhancer besteht aus 750 mM MgCl ₂ und 300 mM ZnCl _2. Hinzufügen Bindungsverstärker, wenn die Bindung des TF an DNA auf Cofaktoren oder Reduktionsmittel abhängig ist. Wenn diese Informationen nicht bekannt ist, fügen Sie den Bindungsverstärker.
   3. In 10 ul 5 uM biotinylierten Fänger-DNA (50 pmol) zu jeder jeweiligen Bindungsmischung. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Die Inkubationszeit und Temperatur variieren in Abhängigkeit von der TF. Die optimalen Werte müssen experimentell bestimmt werden.
4. 100 l Streptavidin-Mikrokügelchen. Inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur.
5. Für jede Oligo-Sonde getestet, legen Sie eine verbindliche Spalte in der Magnetscheider. Legen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen direkt unter jeder Bindungssäule und anwenden 100 ul Bindungspuffer der Säule zu spülen.
6. Pipettieren den Inhalt der einzelnen Bindungsmischung in separaten Spalten und die Flüssigkeit vollständig durch die Säule in die Mikro fließenRohr, bevor Sie fortfahren. Achten Sie darauf, die Spalten mit der Variante Oligo zu kennzeichnen, die in der Bindungsmischung verwendet wurde. Beschriften Sie die Flow-Through-Proben und ersetzen sie durch neue Mikrozentrifugenröhrchen, die mit geringer Stringenz Waschungen zu sammeln.
7. Bewerben 100 ul niedrig stringenten Waschpuffer auf die Säule; warten, bis die Säule Behälter leer ist. Wiederholen Sie waschen 4x. Beschriften Sie die niedrigen Stringenz Waschproben und ersetzen sie durch neue Mikrozentrifugenröhrchen, die mit hoher Stringenz Waschungen zu sammeln.
8. Anwenden 100 ul hoher Stringenz-Waschpuffer auf die Säule; warten, bis die Säule Behälter leer ist. Wiederholen Sie waschen 4x. Beschriften Sie die mit hoher Stringenz Waschproben und ersetzen sie durch neue Mikrozentrifugenröhrchen die Vorelution zu sammeln.
9. In 30 ul nativen Elutionspuffer auf die Säule und lassen Sie sich für 5 Minuten stehen. Beschriften Sie die Vorelution Proben und ersetzen sie durch neue Mikrozentrifugenröhrchen die Elution zu sammeln.
   Hinweis: Das ist nicht das gebundene Protein nicht eluieren; es wäscht die verbleibende hoher Stringenzaus dem Säulenpuffer und ersetzt sie durch Elutionspuffer die Effizienz der Elution zu maximieren.
10. Fügen Sie einen zusätzlichen 50 ul nativen Elutionspuffer die gebundenen TFs zu eluieren. Für eine höhere Ausbeute, aber weniger konzentrierte Eluat, fügen Sie eine zusätzliche 50 ul nativen Elutionspuffer und die Durchfluss sammeln.
    Hinweis: Analysieren Elution Proben durch Massenspektrometrie ³² die Identität des gebunden TFs zu bestimmen. Anschließend überprüfen Sie die Proteom - Ergebnisse durch Natriumdodecyl- Sulfit - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) , gefolgt von einem Western - Blot - ^33. Wenn Massenspektrometrie nicht verfügbar ist, führen Sie eine Silberfärbung unter Verwendung von Standard-Technik anstelle eines Western-Blot, der die Größe des Proteins (e) zeigt Genotyp-abhängige Bindung zu bestimmen. Verwenden Sie diese Informationen zu verengen die Liste der vorhergesagten TFs von den Rechenansätze in der Einleitung beschrieben.

Ergebnisse

In diesem Abschnitt repräsentative Ergebnisse von dem, was zu erwarten, zur Verfügung gestellt, wenn ein EMSA oder DAPA Durchführung und die Variabilität in Bezug auf die Qualität des Lysats gekennzeichnet ist. Beispielsweise wurde vorgeschlagen, dass mehrere Male Einfrieren und Auftauen Proteinproben in Denaturierung führen kann. Um die Reproduzierbarkeit der EMSA-Analyse im Rahmen dieser "Frost-Tau" Zyklen, zwei 35 bp Oligos unterschiedlichen an einer genetischen Varian...

Diskussion

Obwohl Fortschritte in der Sequenzierung und Genotypisierung Technologien stark unsere Fähigkeit, mit der Krankheit genetische Varianten assoziiert zu identifizieren verbessert haben, unsere Fähigkeit, die Funktionsmechanismen von diesen Varianten betroffen zu verstehen, hinkt. Eine wichtige Ursache des Problems ist, dass viele krankheitsassoziierten Varianten in n angeordnet sind on-kodierenden Regionen des Genoms, die wahrscheinlich Einfluss auf schwieriger zu sagen voraus Mechanismen Genexpression steuern. Hi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1 M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1x)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1 M)	Sigma	646563	Reducing agent
Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	87786	Prevents catabolism of TFs
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10x)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/ml of penicillin, 10,000 µg/ml of streptomycin, and 25 µg/ml of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25 mM HEPES