Kinematische Analyse der Zellteilung und Expansion: Die Quantifizierung der zellulären Grundlagen der Wachstums- und Sampling Entwicklungszonen in<em&gt; Zea Mays</em&gt; Blätter

Zusammenfassung

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Zusammenfassung

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Einleitung

Wachstumsanalyse hängt von einer Reihe von Werkzeugen, die von Pflanzenwissenschaftler häufig verwendet werden, Genotyp bestimmt Wachstumsunterschiede und / oder phänotypische Reaktionen auf Umweltfaktoren zu beschreiben. Dazu gehören Größe und Gewichtsmessungen der gesamten Anlage oder ein Organ und Berechnungen der Wachstumsraten, die zugrunde liegenden Mechanismen des Wachstums zu erkunden. Organwachstum wird durch Zellteilung und Expansion auf der zellulären Ebene bestimmt. Daher analysiert die Quantifizierung dieser beiden Prozesse in Wachstum einschließlich ist der Schlüssel zum Verständnis der Unterschiede in Vollorganwachstum ^1. Folglich ist es wichtig, eine geeignete Methodik haben zellulären Wachstumsparameter zu bestimmen, der relativ leicht von nicht spezialisierten Labors zu verwenden.

Kinematic Analyse wurde bereits als Ansatz etabliert ² einen leistungsstarken Rahmen für die Entwicklung von Organwachstumsmodelle bieten. Die Technik wurde für lineare Systeme optimiert,wie Arabidopsis thaliana Wurzeln und monokotyle Blätter, sondern auch für nichtlineare Systeme, wie dikotyle Blätter ^3. Heute wird diese Methode immer mehr, wie genetische Studie verwendet wird, hormonelle, entwicklungs und Umweltfaktoren beeinflussen die Zellteilung und die Expansion in verschiedenen Organen (Tabelle 1). Darüber hinaus bietet sie auch einen Rahmen zelluläre Prozesse auf die ihnen zugrunde liegenden biochemischen, molekularen und physiologischen Bestimmungen (Tabelle 2) zu verbinden, obwohl Einschränkungen können durch Organgröße und räumliche Organisation für Techniken , die höhere Mengen an Pflanzenmaterial erfordern auferlegt werden (zB Metaboliten Messungen, Proteomics, etc.).

Monokotylen Blätter, wie beispielsweise Mais (Zea mays) Blatt-, für lineare Systeme , in denen Zellen von der Basis des Blattes gegen die Spitze zu bewegen, der Reihe nach durch die Meristem und Dehnungszone Leiten des reifen zu erreichenZone. Dies macht es zu einem idealen Modellsystem für quantitative Untersuchungen der räumlichen Muster des Wachstums ^4. Darüber hinaus haben Maisblätter große Wachstumszonen (Meristem und Dehnungszone über mehrere Zentimeter ⁵⁾ und in anderen Organisationsebenen Möglichkeiten für Studien. Dies ermöglicht die Untersuchung der (vermeintlichen) Regulationsmechanismen der Zellteilung steuern und Expansion, durch kinematische Analyse durch eine Reihe von molekularen Techniken quantifiziert, physiologische Messungen und Zellbiologie Ansätze (Tabelle 2).

Hier stellen wir ein Protokoll für eine kinematische Analyse in monokotylen Blätter durchführt. Zuerst wird erklärt, wie eine richtige Analyse der sowohl die Zellteilung und Zell Dehnung als Funktion der Position längs der Blattachse zu leiten und wie kinematischen Parameter zu berechnen. Zweitens zeigen wir auch, wie diese als Grundlage für die Stichprobenplan verwendet werden können. Hier diskutieren wir zwei Fälle: hochauflösende Abtastung eind konzentriert Probenahme, verbesserte Dateninterpretation und die Einsparung von Zeit / Geld ermöglicht, respectively.

Tabelle 1 Übersicht der kinematischen Analysen Methoden zur Quantifizierung der Zellteilung und Expansion in verschiedenen Organen.

Organ	Referenz
monokotylen Blätter	16, 20, 21, 22
Wurzelspitzen	2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
dikotylen Blätter	21, 30, 31
Sprossapikalmeristem	32

Tabelle 1 Übersicht der kinematischen Analysen Methoden zur Quantifizierung der Zellteilung und Expansion in verschiedenen Organen.

Tabelle 2 Zusammenhang zwischen zellulärer Prozesse quantifiziert durch die kinematische Analyse auf ihre Regulation auf molekularer Ebene. Verweise auf verschiedene Studien , die die Quantifizierung von zellulären Prozessen zu den Ergebnissen von biochemischen und molekularen Assays in verschiedenen Spezies und Organen. Xyloglucan endotransglucosylase (XET), Malondialdehyd (MDA), Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Das folgende Protokoll für kinematische Analyse gilt nur für Blätter im stationären Zustand Wachstum. Dies impliziert eine stabile Blattdehnungsrate und räumlichen Muster der Zellenlänge und Expansion in einem Blatt während eines Zeitraums von mehreren Tagen ^6.

1. Pflanzenwachstum und die Messungen der Blattdehnungsrate (LER)

1. Wählen Sie ein Blatt im Steady-State-Wachstum und eine Entwicklungsphase von Interesse.
   HINWEIS: Es gibt einen Unterschied zwischen Steady-State-Wachstum und repetitive Wachstum, das auf aufeinanderfolgenden Blättern auf der gleichen Achse ähnliche räumliche Muster impliziert. Während der frühen Stadien der Sämlingwachstum wachsen sukzessive Blätter typischerweise immer schneller durch die zunehmende Größe der Wachstumszone ^7. Obwohl einige höhere Blattpositionen ein ähnliches Wachstumsmuster ⁸ haben kann, ist dies eine Übergangsphase , die durch Behandlungen zu untersuch beeinträchtigt werden kann. Es ist daher wichtig zu vergleichen Linien und tr eatments streng auf der gleichen Blattposition, auch wenn es zu einer anderen Zeit entwickeln kann. Selbst bei einer konstanten Dehnungsrate, ist die Wachstumsrate Profil nicht notwendigerweise gleich in verschiedenen Entwicklungsstadien. Daher ist es wichtig , Blätter an der gleichen Entwicklungsstufe ⁸ zu analysieren, in der Regel durch die Anzahl der Tage nach dem Auflaufen definiert.
2. Um eine vollständige kinematische Analyse des Blattwachstums in Monokotyledonen zuführen, wachsen mindestens 15 Pflanzen für jede Behandlung und Genotyp unter kontrollierten Bedingungen in einem Wachstumsraum.
3. Zu der Zeit , das Blatt von Interesse erscheint (Austritt aus dem Quirl der umliegenden Blätter), starten Sie die Länge der Blattmess täglich mit einem Lineal , bis das Blatt vollständig erweitert ist (Abbildung 1 i). Blattlänge bedeutet die Länge vom Bodenniveau bis zur Spitze des Blattes. Achten Sie darauf, das Blatt zu brechen oder beschädigt werden, da dies möglicherweise sein Wachstum zu verändern.

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Abb . 1: Schematische Darstellung einer kinematischen Analyse von Maisblättern Das Blatt von Interesse wird mit einem Lineal gemessen an drei aufeinanderfolgenden Tagen das Blatt Dehnungsrate (LER) zu berechnen. Danach wird das Blatt geerntet und drei Zentimeter Segment für die Bestimmung der Meristem-Größe verwendet. Dies wird durch Messen der Länge von der Basis bis zu dem distalsten mitotische Figur nach DAPI-Färbung durchgeführt. (A) Beispiele für proliferative Mitosen und (B) gestaltende Mitosen. Die ersten elf Zentimeter von der Blattunterseite auf der anderen Seite der Mitte Vene verwendet 1001 Zentimeter Segmente für die Zelllängenmessungen zu schneiden. Diese Messungen bilden die Grundlage für die Erstellung der Zellenlänge Profil, das die reife Zelllänge (l _mat) und die Länge der Zellen , so dass die Meristem (l _div) zu bestimmen dient. Das LER und l _Matte verwendet , um die Zellproduktionsrate (P) zu berechnen, während l _div und L _mer verwendet , um die Anzahl der Zellen im Meristem (N - _mer) zu berechnen. Wiederum P und N _mer verwendet , um die durchschnittliche Zellenteilungsrate (D) zu berechnen, die die Umkehrung der Zellzyklusdauer (T _c). Pfeile in der gleichen Farbe zeigen Parameter, die die Parameter folgende auf diese Pfeile werden verwendet, um zu berechnen. Maßstabsbalken = 40 um. Römische Zahlen werden verwendet , um bestimmte experimentelle Verfahren in der beschriebenen Protokoll zu beziehen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Ernte

1. In der Entwicklungsphase von Interesse (zB, am dritten Tag nach dem Schlüpfen), wählen Sie mindestens fünf Vertreter pMittelführerinnen aus dem Ansatz, auf dem die kinematische Analyse durchzuführen. Wodurch der Rest der Pflanzen messen, wie in Schritt 1.3 erläutert die endgültige Blattlänge zu bestimmen.
2. Schneiden Sie das oberirdische Teil der Pflanze. Damit die meristematic Teil intakt, schneiden Sie so nah wie möglich an die Wurzeln (Abbildung 1II).
3. Ausgehend von den äußeren Blättern, entfernen Sie alle Blätter auf dem Blatt von Interesse, indem sie sanft eins nach dem anderen Abrollen. Entfernen Sie ggf. ein paar zusätzliche Millimeter von der Basis, um die Blätter zu lösen. Entfernen Sie auch die Spitze und kleine Blätter durch die Blatt von Interesse (Abbildung 1III) eingeschlossen.
4. Schneiden Sie ein 3 cm-Segment, von der Basis auf einer Seite der mittleren Ader beginnen, und bewahren Sie sie in einem 1,5 ml-Röhrchen mit 3 gefüllt: 1 (v: v) absolutem Ethanol: Essigsäure-Lösung (ACHTUNG: Handschuhe tragen) bei 4 ° C für 24 Stunden bis zu mehreren Monaten (Abb 1IV). Dieses Segment wird später verwendet werden, um die Länge des Meristem zu bestimmen.
5. Von demandere Seite der Vene, ein 11 cm - Segment von der Basis (1 v) geschnitten und in einem 15 ml Röhrchen mit absolutem Ethanol bei 4 ° C für mindestens 6 h gefüllten Pigmente (1 vi) zu entfernen.
   HINWEIS: Später, wenn Sie nur die ersten 10 cm der Zellenlänge Profil (siehe Diskussion) zu bestimmen.
6. Erneuern Sie die absolute Ethanol für eine weitere Runde von mindestens 24 Stunden bei 4 ° C Reinigung (Abbildung 1vi).
7. Schließlich ersetzen die absolute Ethanol mit reinem Milchsäure (ACHTUNG: Handschuhe tragen) für die Reinigung und Lagerung bei 4 ° C für 24 Stunden oder bis zur weiteren Verwendung (Abbildung 1vi).

3. Meristem Längenmessungen

1. Bereiten Sie eine Spülung Puffer, der 50 mM Natriumchlorid (NaCl), 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; ACHTUNG: Handschuhe tragen) und 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan-Salzsäure (TRIS-HCl, pH 7).
2. Nehmen Sie die 3 cm Segment aus dem Abschnitt 2.4 und soak es in dem Puffer für 20 min (Abbildung 1vii).
3. Während des Wartens, verwenden Sie den Spülpuffer ein 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Färbelösung von 1 ug / ml herzustellen, es auf Eis und im Dunkeln zu halten.
4. Stain die Kerne durch das meristem Segment für 2-5 min in der DAPI-Färbelösung platzieren. Die Arbeiten auf dem Eis und in der Dunkelheit (Abbildung 1vii).
5. Prüfen Sie, ob Fluoreszenzsignal durch schnell das Segment auf einem Mikroskopie Glasmontage und Abdecken mit einem Deckglas. Die epidermalen Zellen sollten Fluoreszenz zeigen, während die zugrunde liegenden Zellschichten sollten nicht.
6. Wenn die Färbung nicht ausreichend ist, legte das Segment wieder in den DAPI-Färbung Lösung für einige zusätzliche Minuten.
7. Um die Färbung zu stoppen, montieren Sie die Segmente in einem Tropfen Pufferspülung auf einer Mikroskopie Objektträger und Deck mit einem Deckglas.
8. Verwenden Sie ein Mikroskop mit UV-Fluoreszenz bei einer 20-facher Vergrößerung ausgestattet, so dass für die Visualisierung von rund 1.000 epidermal-Zellen auf einmal. Blättern Sie im gesamten Segment und sucht proliferative Mitosefiguren (Metaphase, Anaphase, Telophase und Zytokinese), aber vermeiden prägenden Zellteilung der Entwicklung Stomata (Abbildung 1viii) ^9. Definieren Sie, wo die am weitesten distal gelegene Mitose befindet.
9. Bestimmen die Länge des Meristem durch den Abstand zwischen der Basis des Blattes gemessen wird und die distalste epidermal mitotische Figur. Verwenden Sie eine Bildanalyse - Software (zB ImageJ) über die volle Länge des Bildrahmens zu messen.
   1. Zählen Sie die Anzahl der Bilder , die die volle meristem Länge (von der Blattbasis zu dem am weitesten entfernten Mitose) und multiplizieren Sie diese Zahl durch die Länge eines Rahmens decken die gesamte meristem Länge (Abbildung 1ix) zu erhalten.

4. Zell Länge Profil

1. Nehmen Sie das Segment, das in Milchsäure (Schritt 2.5) und vorsichtig auf der Bank gespeichert. Schneiden Sie die Segmente Witzha Skalpell in 10 Segmente von 1 cm jeweils (Abbildung 1x).
2. Montieren der aufeinanderfolgenden Blattsegmente auf einem Mikroskopie Schieber in einem kleinen Tropfen Milchsäure. Stellen Sie sicher, konsequent auf einen Blick auf die adaxial oder abaxial Seite nach oben. Im Prinzip gibt es keine Präferenz für eine bestimmte Seite.
3. Verwenden Sie ein Mikroskop mit differentiellen Interferenzkontrast (DIC) Optik ausgestattet, um die Segmente zu analysieren, von der Blattbasis beginnen. Messung mit einer Bildanalysesoftware, die Länge von mindestens 20 replicate Epidermiszellen in Dateien unmittelbar neben der Stomata Dateien, um konsequent die gleichen Zelltyp auszuwählen.
   1. Tun Sie dies in gleich beabstandeten Positionen entlang jedes der Segmente (4 Positionen pro Segment ausreichend), und stellen Sie sicher , die entsprechende Position für jede Messung im gesamten Blatt (Abbildung 1 xi) zu notieren.
4. Bestimmen Sie die mittlere Zellenlänge an jedem mm entlang der Blattachse durch eine lokale Polynom Glättung p mitERFAHREN, implementiert in einem R-Skript (Abbildung 1xii; Ergänzende Datei 1).
   HINWEIS: Die R-Skript stellt eine Reihe von Daten mit Glättung erhöht. Die erforderliche Menge der Glättung ist etwas willkürlich und sollte idealerweise nur das lokale Rauschen zu entfernen, aber nicht die gesamte Kurve beeinflussen. Sicherstellen, dass die gleiche Menge an Glättung für alle Proben in einem Experiment zu verwenden.
5. Der Mittelwert der Zellenlänge an jeder Position zwischen den Pflanzen und berechnen Sie die Standardfehler eine Zellenlänge Profil entlang der Blattachse zu schaffen.

5. Die Berechnung der kinematischen Parameter (siehe Zusatz Datei 2)

1. Berechne die LER , indem die Änderung in der Blattlänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten nehmen (beispielsweise 24 Stunden, wie in Schritt 1.3) , und es durch das Zeitintervall dividiert wird .
2. Berechnen der Länge der Wachstumszone (L _gz) entsprechend der Position distal von der Basis , wo Zellen 95% ihrer reifen ce erreichenll Länge auf der Zelllängenprofil geglättet.
   1. Nehmen Sie für jede Position auf der geglättete Zellenlänge Profil 95% des Durchschnitts aller Zellenlängen nach dieser Position (Abbildung 2).
   2. Vergleichen Sie die geglättete Zellenlängen (Schritt 4.4) mit der berechneten 95% Zelllänge in jeder Position. Ausgehend von der Basis des Blattes endet die Wachstumszone an der Position , wo die tatsächliche Zellenlänge entspricht 95% der folgenden Zelllängen (2; siehe Zusatz Data 2).

Abbildung 2:. Die Bestimmung des Endes der Wachstumszone Meristem: An der Stelle , mit einem roten Stern angegeben, ist die tatsächliche Zellengröße von weniger als 95% (rot gestrichelte Linie) der durchschnittlichen Zellgröße aller in dieser Position folgende Zellen (rot solide Linie). Das Ende der Wachstumszone (L _gz, angegeben mit ablue Sterne) liegt dort, wo 95% (gestrichelte blaue Linie) der durchschnittliche Zellgröße aller Zellen im Anschluss an diese Position (durchgezogene blaue Linie) ist gleich der tatsächlichen Zellgröße. Abteilung Zone (D), Dehnungszone (E) und reifen Zone (M). Eine gestrichelte Pfeile , um die Konvergenz zwischen der lokalen Größe und 95% der mittleren Größe über den distalen Teil des Blattes zeigen , wenn sie von den basalen Positionen an der Spitze des Blattes bewegt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Berechnen der Länge der Dehnungszone (L _EL) als die Differenz zwischen der Länge der Wachstumszone (L _gz) und Meristem Größe (L _mer; bestimmt in Schritt 3).
4. Berechnen Sie die reifen Zelllänge (l _mat) als auch die durchschnittliche Zellenlänge in der reifen Zone.
5. Teilen Sie die LER von l _Matte zu erhalten , dieZellproduktionsrate (P).
6. Berechnen der Anzahl von Zellen in der Dehnungszone (N _el) als die Differenz zwischen N und N _{gz mer.} Die Anzahl der Zellen in dem Meristem (N _mer) gleich der Gesamtzahl der in den Intervallen zu Meristem entsprechenden befindlichen Zellen. Die Anzahl der Zellen in der Wachstumszone (N _gz) gleich der Gesamtzahl der in den Intervallen zu der Wachstumszone entsprechenden befindlichen Zellen.
7. Berechnen Sie die durchschnittliche Zellteilungsrate (D) als P / N _mer. Die Zellzyklusdauer (T _c) ist gleich ln (2) / D.
8. Berechnen Sie die Zeit in der Dehnungszone (T _el) durch Teilen N _el durch P. Die Zeit , in der Teilungszone gleich log ₂ (N - _mer) * T _c. Die Länge der Zellen Verlassen des meristem (l _div)gleich der Zelle aus dem geglätteten Zellenlänge Profil am Ende der Meristem Länge.
9. Berechnen Sie die durchschnittliche Zellexpansionsrate (R _el) unter Verwendung folgender Formel: ln (l _Matte) -ln (l _div)] / T _el.

Ergebnisse

Hier zeigen wir einen Vergleich zwischen gut bewässerten Pflanzen (Kontrolle, 54% Wassergehalt des Bodens, (SWC)) und Pflanzen ausgesetzt Dürre Stressbedingungen (Dürre, 34% SWC) in Bezug auf ihre Blattwachstum. Alle Pflanzen wurden in einer Wachstumskammer unter kontrollierten Bedingungen (16 Stunden Tag / 8 h Nacht, 25 ° C / 18 ° C Tag / Nacht, 300-400 & mgr; Em gewachsen ^-2 s ^-1 photosynthetisch aktive Strahlung (PAR). Die Trockenheit bis die richtige SW...

Diskussion

Eine vollständige kinematische Analyse auf Maisblättern ermöglicht die Bestimmung der zellulären Basis des Blattwachstums und ermöglicht die Gestaltung effizienter Probenahmestrategien. Obwohl das Protokoll relativ einfach ist, ist eine gewisse Vorsicht in den folgenden kritischen Schritte empfohlen: (1) Es ist wichtig, die jüngeren, geschlossenen Blätter zu lösen (2.3 Schritt), ohne die meristem zu beschädigen, da meristem Längenbestimmung (Schritt 3) erfordert die vollständige meristem vorhanden sein. Einig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pots	Any	Any	We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate	Any	Any	We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler	Any	Any	An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds	Any	NA	Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel	Any	Any	The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
15 mL falcon tubes	Any	Any	The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes	Any	Any	The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves	Any	Any	Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol	Any	Any	CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98%	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl)	Any	Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Any	Any	CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)	Any	Any	This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Any	Any	Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice	Any	NA	The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide	Any	Any
Cover glass	Any	Any
Tweezers	Any	Any	Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
Image-analysis software	Axiovision (Release 4.8) from Zeiss	NA	The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	NA	Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script	NA	NA	We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.