Análise cinemática da Divisão Celular e Expansão: Quantificar a base celular de crescimento e de amostragem de desenvolvimento zonas em<em&gt; Zea mays</em&gt; Folhas

Resumo

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Resumo

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Introdução

Análise de crescimento depende de um conjunto de ferramentas que são comumente usados ​​por cientistas de planta para descrever as diferenças de crescimento genótipo determinado e / ou respostas fenotípicas a fatores ambientais. Eles incluem tamanho e peso medições da planta inteira ou um órgão e cálculos de taxas de crescimento para explorar os mecanismos subjacentes de crescimento. Crescimento dos órgãos é determinada por divisão celular e de expansão ao nível celular. Portanto, incluindo a quantificação desses dois processos no crescimento análises é fundamental para compreender as diferenças no crescimento do órgão inteiro ^1. Por conseguinte, é fundamental ter uma metodologia adequada para determinar os parâmetros de crescimento celular que é relativamente fácil de usar por laboratórios não especializados.

A análise cinemática já foi estabelecida como uma abordagem fornecendo uma estrutura poderosa para o desenvolvimento de modelos de crescimento de órgãos ^2. A técnica foi optimizado para sistemas lineares,tais como raízes e folhas de Arabidopsis thaliana monocotiledóneas, mas também para os sistemas não lineares, tais como folhas dicotiledóneas ^3. Hoje em dia, esta metodologia está cada vez mais sendo usado para estudar como genética, hormonal, de desenvolvimento e fatores ambientais influenciam a divisão celular e expansão em vários órgãos (Tabela 1). Além disso, também fornece uma estrutura para conectar processos celulares aos seus regulamentos bioquímicas, moleculares e fisiológicos subjacentes (Tabela 2), embora as limitações podem ser impostas por tamanho do órgão e da organização espacial para técnicas que exigem maiores quantidades de material vegetal (por exemplo, metabólitos medições, proteômica, etc.).

Folhas de monocotiledóneas, como o milho (Zea mays) da folha, representam sistemas lineares em que as células se movem a partir da base da folha em direcção a ponta, passando sequencialmente através da zona de meristema e alongamento para atingir a maturidadezona. Isto o torna um sistema modelo ideal para estudos quantitativos dos padrões espaciais de crescimento de ^4. Além disso, folhas de milho têm zonas de grande crescimento (meristema e zona de alongamento abrangendo vários centímetros ⁵⁾ e proporcionar possibilidades para estudos em outros níveis organizacionais. Isto permite a investigação dos mecanismos de regulação (putativos) que controlam a divisão celular e expansão, quantificada por análise cinemática através de uma série de técnicas moleculares, medições fisiológicas e abordagens de biologia celular (Tabela 2).

Aqui, nós fornecemos um protocolo para a realização de uma análise cinemática em folhas de monocotiledôneas. Em primeiro lugar, vamos explicar como conduzir uma análise adequada de ambos divisão celular e alongamento celular como uma função da posição ao longo do eixo da folha e como calcular parâmetros cinemáticos. Em segundo lugar, também mostrar como este pode ser usado como uma base para a concepção de amostragem. Aqui, discutimos dois casos: de alta resolução de uma amostragemd focado amostragem, permitindo uma melhor interpretação dos dados e economia de tempo / dinheiro, respectivamente.

Tabela 1. Visão Geral de cinemática analisa métodos de quantificação da divisão celular e expansão em vários órgãos.

órgão	referência
folhas monocotiledôneas	16, 20, 21, 22
dicas de raiz	2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
folhas de dicotiledôneas	21, 30, 31
atirar meristema apical	32

Tabela 1. Visão Geral de cinemática analisa métodos de quantificação da divisão celular e expansão em vários órgãos.

Tabela 2. A ligação entre os processos celulares quantificados pela análise cinemática a sua regulação ao nível molecular. As referências a diversos estudos de ligação a quantificação de processos celulares com os resultados de ensaios bioquímicos e moleculares em várias espécies e órgãos. Endotransglucosylase xiloglucano (XET), malondialdeído (MDA), quinases dependentes da ciclina (CDK). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Protocolo

NOTA: O protocolo a seguir para análise cinemática é válida apenas para as folhas durante o crescimento em estado estacionário. Tal implica uma taxa de alongamento foliar estável e padrões espaciais de comprimento e expansão celular em uma folha durante um período de vários dias ^6.

1. crescimento da planta e Medidas de alongamento foliar Rate (LER)

1. Escolha uma folha em crescimento em estado estacionário e um estágio de desenvolvimento de interesse.
   NOTA: Há uma diferença entre o crescimento do steady-state e crescimento repetitivo, o que implica padrões espaciais semelhantes nas folhas sucessivas no mesmo eixo. Durante as fases iniciais de crescimento das mudas, folhas sucessivas normalmente crescem cada vez mais rápido devido ao tamanho crescente da zona de crescimento de ^7. Embora algumas posições folha superior pode ter um padrão de crescimento semelhante ^8, isto é uma fase transitória que podem ser afectados pelos tratamentos sob investigação. Por isso, é importante comparar as linhas e tr eatments estritamente na mesma posição da folha, mesmo que possa ser desenvolvimento em um momento diferente. Mesmo a uma taxa de alongamento constante, o perfil da taxa de crescimento não é necessariamente a mesma em diferentes fases de desenvolvimento. Portanto, é importante analisar as folhas no mesmo estágio de desenvolvimento ^8, normalmente definido pelo número de dias após a emergência.
2. Para executar uma análise cinemática cheia de crescimento da folha em monocotiledôneas, crescer pelo menos 15 plantas para cada tratamento eo genótipo sob condições controladas em sala de crescimento.
3. No momento em que a folha de interesse é exibida (surgimento do verticilo de folhas vizinhas), iniciar a medição do comprimento da folha diariamente com uma régua até que a folha seja totalmente expandida (Figura 1-I). comprimento da folha implica o comprimento a partir do nível do solo para a ponta da folha. Tenha cuidado para não quebrar ou danificar a folha, uma vez que este possa alterar o seu crescimento.

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Figura 1:. Visão esquemática de uma análise cinemática de folhas de milho A folha de interesse é medida com uma régua por três dias consecutivos para calcular o alongamento foliar Rate (LER). Em seguida, a folha é colhida e um segmento de três centímetros é usada para a determinação do tamanho de meristema. Isto é feito através da medição do comprimento desde a base até a figura mitótico mais distal, após coloração com DAPI. (A) Os exemplos de figuras de mitose proliferativa e (B) figuras de mitose formativos. As primeiras onze centímetros da base da folha do outro lado da veia meados são usados ​​para cortar dez segmentos de um centímetro de comprimento para medições de células. Essas medições fornecem a base para a criação do perfil de comprimento celular, que serve para determinar o comprimento maduro de células (l _MAT) e o comprimento das células que saem do meristema (l _div). o l e LER _esteira são utilizados para calcular a taxa de produção de células (P), enquanto que L e L _{div mer} são utilizadas para calcular o número de células no meristema _(mer N). Por sua vez, P e N _mer são utilizadas para calcular a taxa de divisão celular média (D), que é o inverso da duração do ciclo celular (t _c). Setas da mesma cor indicam parâmetros que são usados ​​para calcular o parâmetro a seguir nesses flechas. Barras de escala = 40 uM. Algarismos romanos são usados para se referir a procedimentos experimentais específicos descritos no protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. A colheita

1. Na fase de desenvolvimento de interesse (por exemplo, no terceiro dia após a emergência), escolher pelo menos cinco representante plantes do lote em que a condução da análise cinemática. Continuar a medir o resto das plantas, tal como explicado no passo 1.3 para determinar o comprimento da folha final.
2. Corte a parte aérea da planta. Para manter a parte meristematic intacta, corte o mais próximo possível às raízes (Figura 1ii).
3. A partir das folhas externas, remover todos deixa-se à folha de interesse delicadamente desenrolando-los um por um. Se necessário, remover alguns milímetros adicionais a partir da base para separar as folhas. Também remover as folhas apicais e pequenas fechados pela folha de interesse (Figura 1iii).
4. Cortar um segmento de 3 cm, a partir da base de um lado da veia meio, e armazená-la num tubo de 1,5 ml de teste preenchido com 3: 1 (v: v) de etanol absoluto: uma solução de ácido acético (CUIDADO: usar luvas) a 4 ° C durante 24 horas até vários meses (Figura 1iv). Este segmento será mais tarde utilizada para determinar o comprimento do meristema.
5. Deoutro lado da veia, cortar um segmento de 11 centímetros a partir da base (Figura 1 v) e colocá-lo em um tubo de 15 ml cheio com etanol absoluto a 4 ° C durante pelo menos 6 horas para remover pigmentos (Figura 1 VI).
   NOTA: Mais tarde, usar apenas os primeiros 10 cm para determinar o perfil de comprimento celular (ver Discussão).
6. Renovar o etanol absoluto para outra rodada de limpeza a 4 ° C durante pelo menos 24 horas (Figura 1vi).
7. Finalmente, a substituição de etanol absoluto com ácido láctico puro (CUIDADO: usar luvas) para a limpeza e armazenagem a 4 ° C durante 24 h ou até à sua utilização (Figura 1vi).

3. das medições de comprimento meristema

1. Preparar um tampão de lavagem contendo 50 mM de cloreto de sódio (NaCl), ácido etilenodiaminotetra-acético 5 mM (EDTA; CUIDADO: usar luvas) e 10 mM de Tris (hidroximetil) aminometano-ácido clorídrico (Tris-HCl; pH 7).
2. Leve o segmento de 3 cm do ponto 2.4 e assimak-lo no tampão durante 20 minutos (Figura 1vii).
3. Enquanto espera, usar o tampão de lavagem para preparar uma solução de coloração 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) de 1 ug / ml, mantendo-o em gelo e no escuro.
4. Manchar os núcleos através da colocação do segmento de meristema para 2-5 min em solução de coloração DAPI. Trabalhar no gelo e no escuro (Figura 1vii).
5. Verifique se há sinal de fluorescência por rapidamente a montagem do segmento em um vidro microscopia e cobrindo-o com uma tampa de vidro. As células epidérmicas deve mostrar fluorescência, enquanto que as camadas de células subjacentes não deveria.
6. Se a coloração não é suficiente, colocar o segmento de volta na solução de coloração DAPI durante alguns minutos adicionais.
7. Para parar a coloração, montar os segmentos em uma gota de tampão de lavagem em uma lâmina de microscopia e cubra com uma tampa de vidro.
8. Usar um microscópio equipado com UV de fluorescência com uma ampliação de 20X, permitindo a visualização de cerca de 1,000 epidermecélulas ao mesmo tempo. Rolar em todo o segmento e procurar números de proliferação de mitose (metáfase, anáfase, telófase e citocinese), mas evitar a divisão celular formativa dos estômatos em desenvolvimento (Figura 1viii) ^9. Definir onde a figura mitótico mais distal está localizado.
9. Determinar o comprimento do meristema através da medição da distância entre a base da folha e a figura mitótico mais distai epidérmica. Use um software de análise de imagens (por exemplo, ImageJ) para medir o comprimento total do quadro da imagem.
   1. Contar o número de quadros que cobrem o comprimento total meristema (a partir da base da folha a figura mitótico mais distal) e multiplicando este número pelo comprimento de um quadro para obter o comprimento meristema completo (Figura 1ix).

4. celular Comprimento Perfil

1. Leve o segmento que é armazenado em ácido lático (passo 2.5) e colocá-lo cuidadosamente no banco. Corte a sagacidade segmentosha bisturi em 10 segmentos de aproximadamente 1 cm de cada (Figura 1x).
2. Montar os segmentos de folhas sucessivas sobre uma lâmina de microscópio em uma pequena gota de ácido láctico. Certifique-se para enfrentar de forma consistente ou o adaxial ou abaxial para cima. Em princípio, não existe uma preferência para um lado particular.
3. Usar um microscópio equipado com contraste de interferência diferencial (DIC) a óptica, para analisar os segmentos, a partir da base da folha. Medida com um software de análise de imagem do comprimento de pelo menos 20 células epidérmicas replicar em ficheiros directamente adjacentes aos ficheiros estomática, a fim de seleccionar de forma consistente o mesmo tipo de célula.
   1. Faça isso em posições igualmente espaçadas ao longo de cada um dos segmentos (4 posições por bastam segmento), e certifique-se de anotar a posição correspondente para cada medição em toda a folha (Figura 1xi).
4. Determinar o comprimento médio de célula a cada mm ao longo do eixo da folha usando um local de polinomial suavização pROCEDIMENTO, implementado em um R-script (Figura 1xii; Documento Suplementar 1).
   NOTA: O R-script fornece uma série de dados com o aumento da suavização. A quantidade de suavização necessário é um pouco arbitrária e, idealmente, deve apenas remover o ruído local, mas não afeta a curva geral. Certifique-se de usar a mesma quantidade de suavização para todas as amostras dentro de um experimento.
5. Calcular a média dos comprimento de célula em cada posição de entre plantas e calcular o erro padrão para criar um perfil de comprimento de célula ao longo do eixo da folha.

5. Cálculos de cinemáticas parâmetros (veja Documento Suplementar 2)

1. Calcular a LER tomando a mudança no comprimento da folha entre os dois pontos de tempo sucessivos (por exemplo, 24 horas, tal como no passo 1.3) e dividindo-a pelo intervalo de tempo.
2. Calcular o comprimento da zona de crescimento (G _GZ) correspondente à posição distai a partir da base em que as células atingem a 95% do seu ce maduracomprimento LL do perfil de comprimento celular smoothened.
   1. Aqui, para cada posição sobre o perfil smoothened comprimento célula 95% da média de todos os comprimentos de células seguintes que a posição (Figura 2).
   2. Comparar os comprimentos de células smoothened (passo 4.4) com o comprimento de células 95%, calculado em cada posição. A partir da base da folha, a zona de crescimento termina na posição onde o comprimento real da célula é igual a 95% dos seguintes comprimentos de células (Figura 2; ver Dados Suplementar 2).

Figura 2:. Determinar o final da zona de crescimento do meristema: na posição indicada com um asterisco vermelho, o tamanho real da célula é mais pequeno do que 95% (linha pontilhada vermelho) do tamanho de célula médio de todas as células que se segue nesta posição (sólido vermelho linha). A extremidade da zona de crescimento (G _GZ; indicada com abestrela lue) está localizado em que 95% (linha pontilhada azul) do tamanho de célula médio de todas as células que se segue nesta posição (linha azul sólido) é igual ao tamanho real da célula. Divisão zona (D), zona de alongamento (E), e zona madura (M). As setas tracejadas indicam a convergência entre a dimensão local e 95% do tamanho médio sobre a porção distal da folha quando se deslocam a partir das posições basal até a ponta da folha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Calcular o comprimento da zona de alongamento (L _EL) como a diferença entre o comprimento da zona de crescimento (G _GZ) e o tamanho do meristema (L _mer; determinado no passo 3).
4. Calcular o comprimento da célula madura (l _MAT) como o comprimento médio de célula na zona madura.
5. Divida a LER por l _tapete para obter otaxa de produção de células (P).
6. Calcular o número de células na zona de alongamento (N _EL) como a diferença entre o N e N _{GZ mer.} O número de células do meristema _(mer N) é igual ao número total de células localizadas nos intervalos correspondentes ao meristema. O número de células na zona de crescimento _(GZ N) é igual ao número cumulativo de células localizadas nos intervalos correspondentes à zona de crescimento.
7. Calcula-se a taxa de divisão celular média (D) como _mer P / N. A duração do ciclo celular (t _c) é igual a ln (2) / D.
8. Calcular o tempo na zona de alongamento (t _el) dividindo N _el por P. O tempo na zona de divisão igual a ₂ log (N _mer) * T _c. O comprimento de células que saem do meristema (l _div)é igual ao comprimento da célula a partir do perfil de comprimento smoothened celular no final do meristema.
9. Calcular a taxa média de expansão celular (R _el) usando seguinte fórmula: ln (l _mat) -ln (l _div)] / T _el.

Resultados

Aqui, mostramos uma comparação entre as plantas bem irrigadas (controle, o conteúdo de água no solo de 54%, (SWC)) e plantas submetidas a condições de seca de stress (seca, 34% SWC) em termos de crescimento da folha. Todas as plantas foram cultivadas numa câmara de crescimento, sob condições controladas (16 h dia / noite de 8 h, 25 ° C / 18 ° C dia / noite, 300-400 μEm ^-2 seg ^-1 radiação fotossinteticamente activa (PAR). As condições de seca foram es...

Discussão

Uma análise cinemática em folhas de milho integral permite a determinação da base celular de crescimento da folha e permite a concepção de estratégias de amostragem eficientes. Embora o protocolo é relativamente simples, alguma cautela é recomendado nas seguintes passos críticos: (1) É importante destacar as, folhas mais jovens fechados (passo 2.3), sem danificar o meristema, uma vez que a determinação comprimento meristema (passo 3) requer a completa meristema de estar presente. Alguma prática de antemão...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pots	Any	Any	We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate	Any	Any	We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler	Any	Any	An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds	Any	NA	Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel	Any	Any	The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
15 mL falcon tubes	Any	Any	The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes	Any	Any	The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves	Any	Any	Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol	Any	Any	CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98%	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl)	Any	Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Any	Any	CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)	Any	Any	This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Any	Any	Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice	Any	NA	The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide	Any	Any
Cover glass	Any	Any
Tweezers	Any	Any	Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
Image-analysis software	Axiovision (Release 4.8) from Zeiss	NA	The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	NA	Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script	NA	NA	We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.