Analisi cinematica di divisione cellulare e di espansione: Quantificare la base cellulare della crescita e dello sviluppo di campionamento zone in<em&gt; Zea mays</em&gt; Foglie

Riepilogo

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Abstract

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Introduzione

analisi della crescita dipende da una serie di strumenti che vengono comunemente utilizzati dagli scienziati vegetali per descrivere genotipo determinato differenze di crescita e / o risposte fenotipiche a fattori ambientali. Essi comprendono dimensione e peso misurazioni di tutta la pianta o di un organo e calcoli dei tassi di crescita per esplorare i meccanismi alla base della crescita. Crescita degli organi è determinata dalla divisione cellulare e l'espansione a livello cellulare. Pertanto, compresa la quantificazione di questi due processi in crescita analizza è la chiave per comprendere le differenze nella crescita dell'intero ^organo-1. Pertanto, è fondamentale disporre di un metodo adeguato per determinare i parametri di crescita cellulare che è relativamente facile da usare da laboratori non specializzati.

Analisi cinematica è già stato stabilito come un approccio che fornisce un quadro potente per lo sviluppo di modelli di crescita di organi ^2. La tecnica è stata ottimizzata per sistemi lineari,come radici Arabidopsis thaliana e foglie monocotiledoni, ma anche per i sistemi non lineari, come foglie dicotiledoni ^3. Al giorno d'oggi, questa metodologia è sempre più utilizzato per studiare come genetici, ormonali, dello sviluppo e fattori ambientali influenzano la divisione cellulare e di espansione in vari organi (Tabella 1). Inoltre, fornisce anche un quadro di collegare processi cellulari ai loro regolamenti biochimici, molecolari e fisiologici sottostanti (Tabella 2), anche se le limitazioni possono essere imposte in base alle dimensioni degli organi e l'organizzazione spaziale per tecniche che richiedono una maggiore quantità di materiale vegetale (ad esempio, di metaboliti misurazioni, proteomica, etc.).

Foglie monocotyledonous, come il mais (Zea mays) foglie, rappresentano sistemi lineari in cui le cellule si spostano dalla base della foglia verso la punta, sequenzialmente passando attraverso il meristema e l'allungamento zona per raggiungere la maturitàzona. Questo lo rende un sistema modello ideale per studi quantitativi dei modelli spaziali di crescita del ^4. Inoltre, foglie di mais hanno zone di forte crescita (meristema e zona di allungamento che abbracciano diversi centimetri ⁵⁾ e forniscono possibilità per gli studi ad altri livelli organizzativi. Questo permette la ricerca dei (presunti) meccanismi regolatori che controllano la divisione cellulare e di espansione, quantificato da analisi cinematica attraverso una serie di tecniche molecolari, misurazioni fisiologiche, e approcci di biologia cellulare (Tabella 2).

Qui, forniamo un protocollo per l'esecuzione di una analisi cinematica in foglie monocot. In primo luogo, spieghiamo come condurre una corretta analisi sia di divisione cellulare e l'allungamento delle cellule in funzione della posizione lungo l'asse foglia e come calcolare i parametri cinematici. In secondo luogo, mostriamo anche come questo può essere utilizzato come base per il disegno di campionamento. Qui, discutiamo due casi: ad alta risoluzione di campionamento di und focalizzata campionamento, consentendo una migliore interpretazione dei dati e il risparmio di tempo / denaro, rispettivamente.

Tabella 1. Panoramica di cinematica analizza i metodi per la quantificazione della divisione cellulare e di espansione in vari organi.

organo	riferimento
foglie monocotiledoni	16, 20, 21, 22
apici radicali	2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
foglie dicotiledoni	21, 30, 31
sparare meristema apicale	32

Tabella 1. Panoramica di cinematica analizza i metodi per la quantificazione della divisione cellulare e di espansione in vari organi.

Tabella 2. Collegamento tra processi cellulari quantificati dall'analisi cinematica per la loro regolamentazione a livello molecolare. I riferimenti ai vari studi che collegano la quantificazione dei processi cellulari ai risultati di saggi biochimici e molecolari di varie specie e organi. Endotransglucosylase Xyloglucan (XET), malondialdeide (MDA), chinasi ciclina-dipendenti (CDK). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.

Protocollo

NOTA: il seguente protocollo per l'analisi cinematica è valida solo per le foglie durante la crescita di stato stazionario. Questo implica un tasso foglio di allungamento stabile e modelli spaziali di largo cellulare e l'espansione in una foglia durante un periodo di diversi giorni ^6.

1. crescita delle piante e misure di Leaf Allungamento Rate (LER)

1. Scegli una foglia nella crescita di stato stazionario e uno stadio di sviluppo di interesse.
   NOTA: C'è una differenza tra la crescita di stato stazionario e la crescita ripetitivo, il che implica modelli spaziali simili sulle foglie successive sullo stesso asse. Durante le prime fasi di crescita delle piantine, foglie successive tipicamente crescono sempre più velocemente a causa della crescente dimensione della zona di crescita ^7. Anche se un paio di posizioni più elevate foglia possono avere un modello di crescita simile ^8, questa è una fase transitoria che possono essere interessati da trattamenti sotto inchiesta. È quindi importante confrontare linee e tr eatments strettamente dalla stessa posizione del foglio, anche se può essere lo sviluppo in un momento diverso. Anche ad una velocità di allungamento costante, il profilo tasso di crescita non è necessariamente la stessa a differenti stadi di sviluppo. Pertanto, è importante analizzare foglie allo stesso stadio di sviluppo ^8, tipicamente definito dal numero di giorni dopo la nascita.
2. Per eseguire una completa analisi cinematica di crescita delle foglie in monocotiledoni, crescerà almeno 15 piante per ogni trattamento e il genotipo in condizioni controllate in una stanza di crescita.
3. Al momento in cui il foglio di interesse appare (uscita dalla spirale di foglie circostanti), avviare la misurazione della lunghezza del foglio giorno con un righello finché la foglia è completamente espansa (Figura 1i). lunghezza Leaf implica la lunghezza dalla livello del terreno alla punta della foglia. Fare attenzione a non rompere o danneggiare la foglia, dal momento che questo potrebbe alterare la sua crescita.

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Figura 1:. Schema di una analisi cinematica di foglie di mais La foglia di interesse è misurata con un righello per tre giorni consecutivi per calcolare la foglia di allungamento Rate (LER). Successivamente, il foglio viene raccolto e un segmento di tre centimetri è utilizzato per la determinazione delle dimensioni meristema. Questo viene fatto misurando la lunghezza dalla base fino alla figura mitotica più distale dopo colorazione DAPI. (A) Esempi di figure mitotiche proliferative e (b) figure mitotiche formativi. I primi undici centimetri dalla base foglio sull'altro lato della metà venosa sono usati per tagliare dieci segmenti di un centimetro per misure di lunghezza cellule. Queste misurazioni forniscono la base per creare il profilo lunghezza cellule, che serve a determinare la lunghezza maturo cella (l _mat) e la lunghezza delle cellule lasciando il meristema (l _div). Il LER el _stuoia sono utilizzati per calcolare il tasso di produzione di cellule (P), mentre l _div e L _mer vengono utilizzati per calcolare il numero di cellule nel meristema _(mer N). A sua volta, P e N _mer sono utilizzati per calcolare il tasso medio di divisione cellulare (D), che è l'inverso della durata del ciclo cellulare (T _c). Frecce dello stesso colore indicano parametri utilizzati per calcolare il parametro seguente su queste frecce. Barre di scala = 40 micron. Numeri romani sono utilizzati per riferirsi a procedure sperimentali specifici descritti nel protocollo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Fare la raccolta

1. Nella fase di sviluppo di interesse (ad esempio, il terzo giorno dopo la nascita), scegliere almeno cinque rappresentante plants del lotto su cui condurre l'analisi cinematica. Continua a misurare il resto delle piante come spiegato al punto 1.3 per determinare la lunghezza del foglio finale.
2. Tagliare la parte fuori terra della pianta. Per mantenere la parte meristematica intatto, tagliare il più vicino possibile alle radici (Figura 1ii).
3. Partendo dalle foglie esterne, rimuovere tutte le foglie fino alla foglia di interesse srotolando delicatamente uno per uno. Se necessario, rimuovere alcuni millimetri supplementari dalla base staccare le foglie. Rimuovere anche le foglie apicali e piccoli racchiusi dalla foglia di interesse (Figura 1iii).
4. Tagliare un segmento 3 cm partendo dalla base su un lato della metà della vena, e memorizzarlo in una provetta da 1,5 ml di prova riempito con 3: 1 (v: v) etanolo assoluto: soluzione di acido acetico (ATTENZIONE: indossare guanti) a 4 ° C per 24 ore fino a diversi mesi (Figura 1iv). Questo segmento verrà successivamente utilizzato per determinare la lunghezza del meristema.
5. DalDall'altra parte della vena, tagliare un segmento 11 centimetri dalla base (Figura 1 v) e collocarlo in una provetta da 15 ml riempito con etanolo assoluto a 4 ° C per almeno 6 ore per rimuovere i pigmenti (Figura 1 vi).
   NOTA: In seguito, utilizzare solo i primi 10 cm per determinare il profilo di lunghezza cella (vedi la discussione).
6. Rinnova l'etanolo assoluto per un altro giro di pulizia a 4 ° C per almeno 24 ore (Figura 1vi).
7. Infine, sostituire il etanolo assoluto con acido lattico puro (ATTENZIONE: indossare guanti) per la pulizia e la conservazione a 4 ° C per 24 ore o fino a quando un ulteriore uso (Figura 1vi).

3. meristem delle misure di lunghezza

1. Preparare un tampone di risciacquo contenente 50 mM di cloruro di sodio (NaCl), 5 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; ATTENZIONE: indossare guanti) e 10 mM Tris (idrossimetil) Acido aminomethane-cloridrico (Tris-HCl, pH 7).
2. Prendere il segmento 3 centimetri dalla sezione 2.4 e cosìak nel buffer per 20 min (Figura 1vii).
3. Durante l'attesa, utilizzare il buffer di risciacquo per preparare una soluzione colorante 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) di 1 ug / ml, mantenendolo su ghiaccio e al buio.
4. Colorare i nuclei ponendo il segmento meristema per 2-5 minuti nella soluzione di colorazione DAPI. Lavorare su ghiaccio e al buio (Figura 1vii).
5. Controllare segnale di fluorescenza montando rapidamente il segmento su un vetro microscopia e coprendolo con un vetro di copertura. Le cellule epidermiche dovrebbero mostrare fluorescenza, mentre gli strati cellulari sottostanti non dovrebbe.
6. Se la colorazione non è sufficiente, mettere il segmento posteriore nella soluzione colorante DAPI per alcuni minuti supplementari.
7. Per interrompere la colorazione, montare i segmenti in una goccia di risciacquo tampone su un vetrino al microscopio e coprire con un vetro di copertura.
8. Utilizzare un microscopio dotato di UV-fluorescenza a un ingrandimento 20X, permettendo la visualizzazione di circa 1.000 epidermcellule di Al in una volta. Scorrere in tutto il segmento e cercare per le figure mitotiche proliferative (metafase, anafase, telofase e citocinesi), ma evitare formativo divisione cellulare della sviluppare stomi (Figura 1viii) ^9. Definire in cui si trova la figura mitotico più distale.
9. Determinare la lunghezza del meristema misurando la distanza tra la base della foglia e la più distale epidermica mitotico figura. Utilizzare un software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ) per misurare la lunghezza del frame dell'immagine.
   1. Contare il numero di fotogrammi che coprono la lunghezza meristema completo (dalla base del foglio alla figura mitotica più distale) e moltiplicare questo numero per la lunghezza di un frame per ottenere la lunghezza meristema completo (Figura 1ix).

4. cella intera Profilo

1. Prendere il segmento che viene memorizzato in acido lattico (passo 2.5) e posizionarla con cautela in panchina. Tagliare la segmenti ingegnoha bisturi in 10 segmenti da 1 cm ciascuno (Figura 1x).
2. Montare i segmenti successivi foglia su una diapositiva microscopio in una piccola goccia di acido lattico. Assicurati di affrontare in modo coerente sia la adaxial o abaxial verso l'alto. In linea di principio, non vi è alcuna preferenza per un particolare lato.
3. Utilizzare un microscopio dotato di contrasto interferenziale differenziale (DIC) ottiche per analizzare i segmenti, partendo dalla base foglia. Misurate con un software di analisi di immagine della lunghezza di almeno 20 cellule epidermiche replica nel file direttamente adiacenti ai file stomatiche al fine di selezionare sempre lo stesso tipo di cellula.
   1. Fate questo in posizioni equidistanti lungo ciascuno dei segmenti (4 posizioni per segmento sufficiente), e assicurarsi di annotare la posizione corrispondente per ogni misura per tutta la foglia (Figura 1xi).
4. Determinare la lunghezza media delle cellule in ogni mm lungo l'asse del foglio utilizzando un locale polinomiale levigante pROCEDURA, implementato in un R-script (Figura 1xii; file supplementare 1).
   NOTA: L'R-script fornisce una serie di dati con l'aumentare lisciatura. La quantità di smoothing richiesto è un po 'arbitraria e idealmente dovrebbe solo togliere il disturbo locale, ma non influenzerà la curva complessiva. Assicurarsi di utilizzare la stessa quantità di smoothing per tutti i campioni all'interno di un esperimento.
5. Media lunghezza cellule in ciascuna posizione tra piante e calcolare l'errore standard per creare un profilo lunghezza cella lungo l'asse del foglio.

5. I calcoli di cinematica parametri (Vedi file supplementare 2)

1. Calcolare il LER prendendo la variazione di lunghezza del foglio tra due punti temporali successive (ad esempio, 24 h, come al punto 1.3) e dividendolo per l'intervallo di tempo.
2. Calcolare la lunghezza della zona di crescita (L _gz) corrispondente alla posizione distale dalla base dove cellule raggiungono il 95% del loro ce maturalunghezza ll sul profilo lunghezza delle cellule lisciato.
   1. Prendiamo ad ogni posizione sulla lisciato profilo lunghezza cella 95% della media di tutte le lunghezze cellulari seguenti tale posizione (figura 2).
   2. Confrontare le lunghezze delle cellule levigati (passo 4,4) con la calcolata lunghezza delle cellule del 95% per ogni posizione. Partendo dalla base della foglia, la zona di crescita termina nella posizione in cui la lunghezza cella effettiva è pari al 95% delle seguenti lunghezze cellulari (Figura 2; vedere integrativa dati 2).

Figura 2:. Determinazione della fine della zona di crescita Meristem: Nella posizione indicata con una stella rossa, la dimensione cella effettiva è inferiore al 95% (linea rossa tratteggiata) della dimensione media delle cellule di tutte le cellule che seguono questa posizione (rosso fisso linea). La fine della zona di crescita (L _gz, indicata con ablue stella) si trova in cui il 95% (linea blu tratteggiata) della dimensione media delle cellule di tutte le cellule che seguono questa posizione (solido linea blu) pari alla dimensione cella effettiva. zona Division (D), zona di allungamento (E), e la zona matura (M). Frecce tratteggiate indicano la convergenza tra la dimensione locale e il 95% della dimensione media sopra la porzione distale della foglia quando si spostano dalle posizioni basali alla punta della foglia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Calcolare la lunghezza della zona di allungamento (L _el) come differenza tra la lunghezza della zona di crescita (L _gz) e la dimensione meristema (L _mer, determinato nel passaggio 3).
4. Calcolare la lunghezza cellula matura (l _mat) come lunghezza media delle cellule nella zona maturo.
5. Dividere il LER per l _tappetino per ottenere latasso di produzione di cellule (P).
6. Calcolare il numero di cellule nella zona di allungamento (N _el) come differenza tra N e N _{gz mer.} Il numero di cellule nel meristema _(mer N) è uguale al numero cumulativo di cellule situate negli intervalli corrispondenti al meristema. Il numero di cellule nella zona di crescita (N _gz) è uguale al numero cumulativo di cellule situate negli intervalli corrispondenti alla zona di crescita.
7. Calcolare il tasso di divisione cellulare medio (D) come P / N _mer. La durata del ciclo cellulare (T _c) uguale ln (2) / D.
8. Calcolare il tempo nella zona di allungamento (T _el) dividendo N _el da P. Il tempo nella zona di divisione è pari a log ₂ (N _mer) * T _c. La lunghezza delle cellule lasciando il meristema (l _div)uguale alla lunghezza cella dal profilo lunghezza cellule lisciato alla fine del meristema.
9. Calcolare il tasso medio di espansione delle cellule (R _el) utilizzando la formula seguente: ln (l _mat) -ln (l _div)] / T _el.

Risultati

Qui, si mostra un confronto tra le piante ben irrigate (controllo, contenuto idrico del suolo 54%, (SWC)) e le piante sottoposte a condizioni di stress siccità (siccità, 34% SWC) in termini di crescita delle foglie. Tutte le piante sono state coltivate in una camera di crescita in condizioni controllate (16 ore al giorno / notte 8 ore, 25 ° C / 18 ° C giorno / notte, 300-400 μEm ^-2 sec ^-1 fotosinteticamente radiazione attiva (PAR). Le condizioni di siccità son...

Discussione

Una completa analisi cinematica sulle foglie di mais consente la determinazione della base cellulare della crescita delle foglie e consente la progettazione di strategie di campionamento efficienti. Anche se il protocollo è relativamente semplice, una certa cautela è raccomandata nei seguenti passaggi critici: (1) E 'importante staccare le foglie più giovani chiusi (punto 2.3) senza danneggiare il meristema, dal momento che la determinazione lunghezza meristema (fase 3) richiede la completa meristem di essere pre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pots	Any	Any	We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate	Any	Any	We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler	Any	Any	An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds	Any	NA	Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel	Any	Any	The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
15 mL falcon tubes	Any	Any	The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes	Any	Any	The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves	Any	Any	Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol	Any	Any	CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98%	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl)	Any	Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Any	Any	CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)	Any	Any	This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Any	Any	Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice	Any	NA	The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide	Any	Any
Cover glass	Any	Any
Tweezers	Any	Any	Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
Image-analysis software	Axiovision (Release 4.8) from Zeiss	NA	The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	NA	Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script	NA	NA	We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author.