Unterteilung menschlicher Stammzellen-abgeleiteter Neuronen in vormontierte Mikrofluidchips aus Kunststoff

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von kompartalisierten mikrofluidischen Chips, die in einem zyklischen Olefin-Copolymer in kultivierte Neuronen gegossen werden, die von menschlichen Stammzellen unterschieden werden. Diese Chips sind vormontiert und einfacher zu verwenden als herkömmliche, kompartalisierte Polygeräte (Dimethylsiloxan). Mehrere gängige experimentelle Paradigmen werden hier beschrieben, einschließlich viraler Etikettierung, fluidischer Isolation, Axotomie und Immunfärbung.

Zusammenfassung

Die Verwendung von mikrofluidischen Geräten zur Abschottung kultivierter Neuronen ist zu einer Standardmethode in der Neurowissenschaft geworden. Dieses Protokoll zeigt, wie ein vormontierter Multi-Fach-Chip aus einem zyklischen Olefin-Copolymer (COC) verwendet wird, um Neuronen zu unterteilen, die sich von menschlichen Stammzellen unterscheiden. Der Fußabdruck dieser COC-Chips ist derselbe wie bei einem Standard-Mikroskopschlitten und gleichermaßen kompatibel mit hochauflösender Mikroskopie. Neuronen werden von menschlichen neuronalen Stammzellen (NSCs) zu glutamatergen Neuronen innerhalb des Chips unterschieden und für 5 Wochen aufrechterhalten, so dass genügend Zeit für diese Neuronen, um Synapsen und dendritische Stacheln zu entwickeln. Darüber hinaus zeigen wir mehrere gängige experimentelle Verfahren mit diesen Multi-Compartment-Chips, einschließlich viraler Kennzeichnung, Einrichtung von Mikroumgebungen, Axotomie und Immunzytochemie.

Einleitung

Menschliche Stammzell-differenzierte Neuronen (hSC-Neuronen) werden zunehmend für die biologische Forschung verwendet. Diese Neuronen, die aus menschlichem Quellenmaterial abgeleitet werden können, sind von großem Interesse für die translationale Forschung, einschließlich der Untersuchung traumatischer Hirnverletzungen und neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer. Daher sind Instrumente zur Verbesserung und Erleichterung der Untersuchung von hSC-Neuronen gefragt.

Um die einzigartige polarisierte Morphologie von Neuronen zu untersuchen, verwenden viele Forscher multi-kompartalisierte mikrofluidische Geräte^{1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11}. Diese Geräte ermöglichen Messungen und Manipulationen von langprojektionsneuronen mit einzigartigem subzellulären Zugriff. Multi-kompartalisierte mikrofluidische Geräte bestehen aus zwei parallelen mikrofluidischen Kompartimenten, die durch Mikronuten getrennt sind und das axonale Wachstum steuern. Neuronen oder neuronale Stammzellen (NSCs) werden im somatodendritischen Fach plattiert und haften dann nach Minuten an der Unterseite der Fachoberfläche. Differenzierte Neuronen wachsen und erweitern ihre Axone/Projektionen durch die Mikronutregion in ein angrenzendes und isoliertes Axonfach. In der Vergangenheit wurden diese Geräte ausschließlich mit Poly (Dimethylsiloxan) (PDMS) Replikformhergestellt hergestellt. PDMS-Geräte haben viele Nachteile, die zuvor beschrieben wurden¹², einschließlich persistenter Hydrophobie und der Notwendigkeit, sich unmittelbar vor der Verwendung zu einem Glasdeckel zusammenzusetzen. Vormontierte Spritzgusschips überwinden viele dieser Nachteile und werden kommerziell verkauft (siehe Tabelle der Materialien)¹². Die Fächer dieser Chips sind permanent hydrophil und der gesamte Chip wird in optisch transparentes zyklisches Olefin-Copolymer (COC) gegossen.

Dieses Protokoll zeigt, wie man diesen COC-Chip verwendet, um menschliche NSCs in erregende Neuronen zu differenzieren und ihre langen neuronalen Projektionen zu trennen und fließend zu isolieren. Für diese Demonstration wurden Neuronen von NIH-zugelassenen H9-Stammzellen unterschieden. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um humaninduzierte pluripotente Stammzellen zu unterscheiden.

Protokoll

ANMERKUNG: Abbildung 1A,B zeigt einen Schaltplan des vormontierten COC-Chips, einschließlich der Positionen der Hauptkanäle oder Fächer, Brunnen und Microgrooves. Der kompartumnierte Chip kann verschiedene fluidische Mikroumgebungen innerhalb eines Fachs etablieren, wie die Isolierung von Lebensmittelfärbefarbstoffen zeigt (Abbildung 1C). Das Protokoll zur Vorbereitung des vormontierten Multi-Fach-Chips ist in Nagendran et al., Abschnitt 1¹²angegeben.

1. Beschichtung von Multi-Fach-Chips für hSC-Neuronen

HINWEIS: Abbildung 2A zeigt einen Überblick über die Beschichtungsverfahren.

1. Lösen Sie Poly-L-Ornithin in zellkulturbasiertem destilliertem Wasser auf, um 600 l Lösung pro Chip einer Arbeitslösung von 20 g/ml herzustellen.
2. Aspirieren Sie die verbleibendePBS nach der Vorbereitung der Chips aus den Brunnen links. Stellen Sie beim Ansaat sicher, dass die Pipettenspitze von der Kanalöffnung entfernt ist.
   HINWEIS: Die mikrofluidischen Kanäle müssen während des gesamten Verfahrens gefüllt bleiben. Beschwichtigen Sie keine Flüssigkeit aus den Kanälen/Fächern, sondern nur die Brunnen.
3. Laden Sie 150 l Poly-L-Ornithin-Arbeitslösung in den oberen rechten Brunnen. Warten Sie auf 90 s oder bis die Flüssigkeit beginnt, die untere rechte gut zu füllen. Fügen Sie 150 L Medien in den unteren rechten Brunnen und warten Sie 5 min, um die Flüssigkeit durch die Microgrooves passieren zu lassen.
4. Fügen Sie 150 L Medien oben links gut hinzu. Warten Sie 90 s und fügen Sie dann 150 l zum unteren linken Brunnen hinzu. Den Halter des Chips mit Parafilm umwickeln und über Nacht bei 4 °C platzieren.
   HINWEIS: Alternativ den Chip und den Halter bei 37 °C für 1 h platzieren.
5. Saugen Sie die Medien aus den Brunnen, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze weg von der Kanalöffnung platziert wird. Fügen Sie 150 l steriles Wasser in den oberen rechten Brunnen. Warten Sie auf 90 s und fügen Sie dann 150 l zum unteren rechten Brunnen hinzu. Warten Sie 5 min, um die Flüssigkeit durch die Microgrooves passieren zu lassen.
6. Fügen Sie 150 l steriles Wasser in den oberen linken Brunnen, warten Sie 90 s und fügen Sie dann weitere 150 l auf der unteren linken Gut.
7. Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.6.
8. Laminin langsam bei 2 °C bis 8 °C auftauen und eine Arbeitslösung von 10 g/ml vorbereiten.
9. 150 l der Laminin-Arbeitslösung in den oberen rechten Brunnen legen. Warten Sie auf 90 s oder bis die Flüssigkeit beginnt, die untere rechte gut zu füllen. Pipetten Sie 150 l nach unten rechts gut. Warten Sie 5 min, um das Laminin durch die Mikrorillen gehen zu lassen.
10. Fügen Sie 150 l Laminin oben links gut hinzu. Warten Sie 90 s und fügen Sie dann 150 l zum unteren linken Brunnen hinzu. Den Chip in seinem Halter für 2 h bei 37 °C inkubieren.
11. Spülen Sie den Chip mit PBS (ohne Ca²⁺ und Mg²⁺). Laden Sie 150 l PBS auf den oberen rechten Brunnen. Warten Sie auf 90 s oder bis die Flüssigkeit beginnt, die untere rechte gut zu füllen. Fügen Sie 150 L PBS in den unteren rechten Brunnen und warten Sie 5 min, um die PBS durch die Microgrooves gehen zu lassen.
12. Pipetten Sie 150 l PBS oben links gut. Nach 90 s Pipette 150 l unten links gut.
13. PBS vom Chip aussaugen und dann den Chip mit NSC-Medien abspülen (siehe Materialtabelle). Laden Sie 150 L Medien auf den oberen rechten Brunnen. Nach 90 s oder wenn Flüssigkeit durch den rechten Kanal in den unteren rechten Brunnen gelangt, fügen Sie 150 l zum unteren rechten Brunnen hinzu. Warten Sie 5 min, um die Medien durch die Microgrooves fließen zu lassen.
14. Fügen Sie 150 L Medien in den oberen linken Brunnen und weitere 150 L zum unteren linken Brunnen hinzu. Inkubieren Sie den Chip in einem 37 °C Inkubator mit 5% CO2, um den Chip vorzukonditionieren, bis er zum Aussaat von NSCs bereit ist.
    HINWEIS: Chips können bei Bedarf über Nacht vorkonditioniert werden.

2. Saatn-NS-Codes in den Multicompartment-Chip

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet kommerziell erworbene NSCs, im Gegensatz zu unserer vorherigen Veröffentlichung, die mit menschlichen embryonalen Stammzellen begann⁵. In diesem Protokoll werden neuronale Stammzellen direkt in die Plastikchips eintellert, wo sie sich in Neuronen differenzieren. Die Zellen können sich als NSCs (ohne Differenzierung) für bis zu 2 Passagen vermehren und in Fläschchen in Flüssigkeit N₂ zur weiteren Verwendung lagern. Dieses Protokoll verwendet NSC-Fläschchen, die nach Durchgang 1 oder 2 in Flüssigkeit N₂ gelagert werden. Abbildung 2B zeigt einen Überblick über die Beschichtungsverfahren.

1. Thaw NSCs nach Herstelleranweisungen.
   HINWEIS: Dieses Verfahren gilt für Von H9 abgeleitete NSCs. Andere Zelllinien erfordern eine Optimierung der Zelldichte.
2. Zählen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und passen Sie sie mit NSC-Medien an, um eine Konzentration von 7 x 10⁶ Zellen pro ml zu erhalten.
3. Aspirieren Sie Medien aus jedem Brunnen des Chips. Vermeiden Sie das Ansatosen von Medien von den Hauptkanälen.
4. Pipetten Sie 5 l der Zelllösung auf den oberen rechten Brunnen, gefolgt von 5 l bis zum unteren rechten Brunnen (70.000 Zellen insgesamt). Stellen Sie sicher, dass die Zellen in Richtung der Hauptkanalöffnungen geleitet werden. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob Zellen in den Kanal eingedrungen sind. Warten Sie 5 min, bis die Zellen an der Unterseite des Chips haften.
   HINWEIS: Entweder oder beide Fächer können zum Laden von Zellen verwendet werden.
5. Pipetten Sie 150 L NSC-Medien an den oberen rechten Brunnen und dann 150 l bis zum unteren rechten Brunnen. Wiederholen Sie dies auf der linken Seite. Inkubieren Sie bei5% CO2 , 37 °C in einem geeigneten befeuchteten Behälter.
6. Nach 48 Stunden, aspirieren NSC-Medien aus den Brunnen und ersetzen sie durch neuronale Differenzierungsmedien, indem Sie 150 l zu jedem oberen Brunnen und jedem unteren Brunnen hinzufügen.
7. Kulturneuronen in einem5% CO2, 37 °C Inkubator in einem geeigneten befeuchteten Behälter.
   HINWEIS: Medien sollten alle 2-3 Tage ausgetauscht werden. Aufgrund der geringen Mengen, die im Chip verwendet werden, kann die Verdunstung auch innerhalb eines befeuchteten Inkubators die Zelllebensfähigkeit erheblich beeinträchtigen. Verwenden Sie einen geeigneten Sekundärbehälter, um zusätzliche Feuchtigkeit für die langfristige Zellkultur mit dem Chip bereitzustellen (siehe Tabelle der Materialien).

3. Virale fluoreszierende Kennzeichnung von hSC-Neuronen innerhalb des Chips

HINWEIS: Mehrere Viren können verwendet werden, um Neuronen innerhalb des Chips zu kennzeichnen. Die folgenden Anweisungen beschreiben die Verwendung von G-gelöschten Tollwut-mCherry oder -eGFP Virus. Potenziell infektiöse Materialien müssen gemäß den geltenden Regeln und Vorschriften behandelt werden und können zusätzliche Schulungen und institutionelle Genehmigungen erfordern.

1. Warm 400 L frische neuronale Differenzierungsmedien pro Chip auf 37 °C.
2. Entfernen Sie 50 L Medien aus einem Brunnen des Axonfachs in ein Zentrifugenrohr und fügen Sie dann 100.000 virale Einheiten des modifizierten Tollwutvirus in das Rohr.
   HINWEIS: Entsorgen Sie verbrauchte Pipettenspitzen und Zentrifugenröhren, die Viren enthalten.
3. Entfernen Sie die verbleibenden neuronalen Differenzierungsmedien aus dem axonalen Fach und legen Sie sie in ein Zentrifugenrohr. Bei 37 °C lagern.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kanäle mit Flüssigkeit gefüllt bleiben.
4. Mischen Sie die 50 L Viruslösung mit 150 L erwärmten Medien. Pipetten Sie 100 l an einen Brunnen des Axonfachs und 100 l auf den anderen Axonfachbrunnen. Inkubieren Sie für 2 h in einem 37 °C Inkubator.
   HINWEIS: Der Volumenunterschied zwischen den axonalen und somatischen Fächern trägt dazu bei, dass das Virus während der Infektions-/Inkubationszeiten im Axonfach verbleibt.
5. Zurückziehen und virushaltige Medien entsorgen.
   VORSICHT: Entfernen Sie keine Flüssigkeit innerhalb der geschlossenen mikrofluidischen Kanäle.
6. 75 L Frischmedien vorsichtig auf ein Axonfach gut pfeifen und die Medien durch den Kanal in ein anderes Axon gut fließen lassen.
7. Entfernen Sie die Medien aus dem Axonfach und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß.
8. Wiederholen Sie die Schritte 3.6 und 3.7.
9. Füllen Sie das Axonfach mit dem gespeicherten Medium. Pipet ein zusätzliches 50 L frisches Medium, falls erforderlich, und geben Sie den Chip dann an den Inkubator zurück. Diese zusätzlichen Frischmedien sollen auf Medienverlust während des Flüssigkeitstransfers und der Verdunstung während des Prozesses angerechnet werden.
   HINWEIS: Sichtbare fluoreszierende Kennzeichnung mit diesen modifizierten Tollwutviren tritt um 48 h und bis zu 8 Tage auf, nach denen der Zelltod infizierter Neuronen in der Regel aufgrund von Virustoxizität auftritt. Neuronenbildgebung kann wie bei anderen Standard-Kulturplattformen (z. B. Glasbodenschalen) durchgeführt werden, aber besondere Aufmerksamkeit ist erforderlich, um genügend Feuchtigkeit zu erhalten, um Verdunstungsverluste zu verhindern.

4. Fluidische Isolierung, Axotomie und Immunfärbung innerhalb des Chips

1. Folgen Sie der fluidischen Isolierung, Axotomie und Immunfärbung mit dem Chip, wie in Nagendran et al.¹²beschrieben.

Ergebnisse

Nach einer Woche (7-10 Tage) im Chip mit Differenzierungsmedien differenzieren sich NSCs in Neuronen und neuronale Projektionen gelangen in das axonale Fach (Abbildung 3). Innerhalb des Chips befestigen und verteilen Neuronen gleichmäßig im somatischen Fach. Im Vergleich dazu verklumpen/aggregatieren Neuronen in PDMS-Geräten bereits 5 Tage nach der Zugabe von Differenzierungsmedien, was zu einer beeinträchtigten Zellgesundheit führt, wie in Abbildung 3B (Tag 13 vergrößertes Bild) zu sehen ist. Neuronen in den Chips sehen mit gebündelten Axonen gesund aus. Gesunde Neuronen können innerhalb der Chips für 4-5 Wochen gepflegt werden.

Um die Neuronenreifung und die Entwicklung der dendritischen Wirbelsäule zu visualisieren, wurde das modifizierte Tollwutvirus an Tag 29 in das axonale Fach geliefert, um retrograde Etikettenneuronen, einschließlich dendritischer Stacheln, mit mCherry fluoreszierendem Protein zu erhalten. Vier Tage nach der Tollwut-Virusinfektion drückten Neuronen, die Axone in das Axonfach ausdehnten, mCherry aus. Die Neuronen am Differenzierungstag 33 zeigten die Bildung von dendritischen Stacheln (Abbildung 4). Die Visualisierung dendritischer Dornen zeigt, dass NSC-abgeleitete Neuronen, die innerhalb der Chips differenziert sind, reife Synapsen bilden.

Der Multi-Kompartier-Chip ist auch mit der Immunzytochemie kompatibel, um die zelluläre Lokalisierung von Proteinen zu visualisieren. Nach 26 Tagen der Aufrechterhaltung der Neuronen in Differenzierungsmedien wurden Neuronen für den exzitatorischen synaptischen Marker, vGlut1 (Abbildung 5) gekennzeichnet. Diese Ergebnisse zeigen, dass viral markierte Neuronen mit vGlut1 (Abbildung 5E) und neuronspezifischem Marker, s-Tubulin III (Abbildung 5F-H) kolokalisieren.

Die Fähigkeit, unterschiedliche Mikroumgebungen zu erstellen, die zu Axonen isoliert sind, wurde auch mit Alexa Fluor 488 Hydrazid, einem niedermolekularen Fluoreszenzfarbstoff, demonstriert (Abbildung 6).

Axon-Verletzungsstudien werden häufig in abgeteilten Geräten durchgeführt. Ein Proof-of-Prinzip-Experiment wurde durchgeführt, um selektiv Axone von differenzierten Neuronen mit dem vormontierten COC-Chip zu verletzen (Abbildung 7). Die Ergebnisse entsprachen Silikon-Fachgeräten^6,13,14.

Abbildung 1: Der vormontierte COC, Multi-Fach-Mikrofluid-Chip. (A) Eine Zeichnung des Chips, der die oberen und unteren Brunnen identifiziert. Die Größe des Chips ist 75 mm x 25 mm, die Größe der Standard-Mikroskop-Dias. (B) Ein vergrößerter Bereich, der die Kanäle und Microgrooves zeigt, die die Kanäle trennen. Weitere Informationen finden Sie in Nagendran et al.¹². (C) Dieses Foto zeigt die Schaffung von isolierten Mikroumgebungen in jedem Fach mit Lebensmittelfärbefarbstoff. Diese ganze Zahl wurde von ¹²reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Kunststoff-Fachspanbeschichtung und NSC-Zellbeschichtungs-Timeline. (A) Kunststoff-Multifach-Chips wurden mit einer Vorbeschichtungslösung beschichtet, und dann Poly-L-Ornithin und Laminin vor der Vorkonditionierung mit NSC-Medien. (B) NSCs wurden mit 7 x 10⁴ Zellen im somatischen Fach des Chips plattiert. Die Zellen wurden in NSC-Medien für 24 h angebaut und dann wurden die Medien durch neuronale Differenzierungsmedien ersetzt. Differenzierte Neuronen wurden durch 7-10 Tage nach der Differenzierung beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: hSC-Neuron-Wachstumsvergleich bei Chips und PDMS-Geräten. (A) Ein Phasenkontrastbild von hSC-Neuronen, die 13 Tage nach der Differenzierung im Kunststoff-Multifachchip gewachsen sind. (B) Ein vergrößerter Bereich von hSC-Neuronen, die innerhalb des weißen Feldes in (A) und einem äquivalenten Bereich innerhalb eines PDMS-Geräts (rechts) kultiviert sind. hSC-Neuronen in den Chips befestigen gut. Aggregierte Neuronencluster bilden sich in PDMS-basierten Geräten. Vertreter von 2 unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Menschliche NSC-abgeleitete Neuronen zeigen dendritische Wirbelsäulenmorphologie. Retrograde beschriftet mCherry Neuron an DifferenzierungTag 33 innerhalb des Chips gewachsen. Die rot umrissene vergrößerte Region hebt das Vorhandensein von dendritischen Stacheln hervor, die die Entwicklung reifer glutamatergischer Synapsen belegen. Rote Pfeile zeigen auf dendritische Stacheln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Menschliche NSC abgeleitete Neuronen, die in Chips kultiviert werden, weisen exzitatorische Synapsen auf. Die Immunostainierung wurde am Differenzierungstag 26 durchgeführt. Neuronenbildgebung wurde im somatischen Fach durchgeführt. A) vGlut1 (grün) und (B) DAPI (blau) Immunolabeling. (C) mCherry-markierte Neuronen (rot) retrograde mit einem modifizierten Tollwutvirus gekennzeichnet. (D) Eine zusammengeführte fluoreszierende Mikrographie von (A-C). (E) Dendritische Stacheln und vGlut1 positive Puncta kolokalisiert mit mCherry-positiven Dendriten, in einem vergrößerten Bereich von (D) gezeigt. Immunfluoreszenz-Mikrographen von (F) neuronspezifischen Marker, s-Tubulin III (Magenta) und (G) vGlut1 (grün). (H) Überlagerung von S-Tubulin III und vGlut1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Viral transduzierte mCherry-Neuronen erweitern Projektionen in eine axonlokalisierte Mikroumgebung, die innerhalb des vormontierten COC-Chips eingerichtet ist. (A) mCherry beschriftet Neuron enden Axone durch die Mikrogrooves des Chips und in ein isoliertes Axonfach. Die Isolierung des Axonfachs wird mit Alexa Fluor 488 Hydrazid visualisiert. Die Bildgebung der Neuronen erfolgte am Differenzierungstag 26 und 3 Tage nach der Infektion mit dem modifizierten Tollwutvirus. (B) Das Fluoreszenzbild in (A) wird mit einem DIC-Bild verschmolzen. Beachten Sie die Position der Microgrooves. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Axotomie, die innerhalb des COC-Multifachchips durchgeführt wird. (A) mCherry beschriftete Neuronen am Differenzierungstag 33 wurden vor der Axotomie abgebildet. 'Fire' Farb-Look-up-Tabelle. (B) Unmittelbar nach der Axotomie, die zeigt, dass Axone vollständig abgetrennt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Kunststoff-Multi-Fach-Chips	PDMS Multi-Fach-Geräte
Axone isolieren	Axone isolieren
Mikroumgebungen einrichten	Mikroumgebungen einrichten
axotomisieren Neuronen	axotomisieren Neuronen
optisch transparent	optisch transparent
kompatibel mit hochauflösender Bildgebung	kompatibel mit hochauflösender Bildgebung
kompatibel mit fluoreszenzmikroskopie	kompatibel mit fluoreszenzmikroskopie
komplett montiert	Montage auf Substrat erforderlich
gesunde Axone >21 Tage	gesunde Axone >14 Tage
hydrophile Kultivierungsfläche	Hydrophobe
Gas undurchlässig	Gas durchlässig
abgerundete Microgrooves und Kanäle	gerade Microgrooves
nicht kompatibel mit Laserablation	Kann zur Laserablation verwendet werden, wenn PDMS-Kammern auf speziellen laserablationskompatiblen Dias montiert werden.
Gerät kann nicht geändert werden, um	Top ist abnehmbar für die Färbung in Microgrooves
nicht kompatibel mit Mineralöl-basierten Tauchölen (Silikon-basierte Öle sind fein)	kompatibel mit Mineralöl-basierten Tauchölen
undurchlässig für kleine Moleküle und organische Lösungsmittel	Absorption von kleinen Molekülen & organischen Lösungsmitteln
Keine Leckageprobleme mit dem Chip	Beschichtung mit Poly-L-Ornithin und Laminin machen die Geräte undicht
differenzierte Neuronen bleiben gleichmäßig verteilt (> 4 Wochen) an den getesteten Zelldichten	differenzierte Neuronen beginnen sich nach 3-4 Tagen in kulturan der getesteten Zelldichten zu aggregieren

Tabelle 1: Vergleich von Multi-Kompartier-COC-Chips und Silikongeräten zur Kultivierung von Neuronen

Diskussion

Der vormontierte Multi-Kompartier-COC-Chip ist eine einfach zu bedienende, unterteilte Plattform, um menschliche NSCs langfristig zu unterscheiden und in Neuronen zu halten (>4 Wochen). In diesem Protokoll zeigen wir die Differenzierung menschlicher NSCs in glutamaterge Neuronen, retrograde Etikettenneuronen, führen Immunzytochemie durch, visualisieren die dendritische Wirbelsäulenmorphologie und führen Axotomie durch. Diese Chips sind mit hochauflösender Bildgebung kompatibel und es gibt keine Autofluoreszenz mit dem COC¹².

COC Multi-Compartment-Chips sind funktional äquivalent zu silikonbasierten kompartalisierten Geräten und haben Vorteile und Nachteile, wie zuvor beschrieben¹². Tabelle 1 vergleicht MULTI-Kompartier-COC-Chips und Silikongeräte zur Kultivierung von hSC-Neuronen. Die COC-teilverfeinerten Chips bieten eine bessere hydrophile Oberfläche für die Befestigung und Wartung von Stammzellen über einen langen Kulturzeitraum. PDMS-basierte Geräte müssen montiert und an Glasabdeckungen befestigt werden. Die hydrophobe Natur der PDMS-Geräte bewirkt die Aggregation von Stammzellen⁵; Dies führt sowohl zu Herausforderungen bei der Bildgebung auf zellulärer Ebene als auch zu einer größeren Anfälligkeit für physische Schäden durch die Bewegung von Zellaggregaten während Medienveränderungen. Der Kunststoffchip überwindet diese Herausforderungen. COC ist gasundurchlässig, im Gegensatz zu PDMS, so dass Lufttaschen, die in den Kanälen eingeschlossen oder gebildet werden, vom Benutzer entfernt werden müssen. Die Vorbeschichtungslösung reduziert die Möglichkeit, dass Luft in den Kanälen gefangen wird. Diese Lösung besteht aus Ethanol und anderen Wirkstoffen. Ein zuvor veröffentlichtes Protokoll zur Kultivierung von murinen Neuronen innerhalb dieser Plastikchips liefert zusätzliche Details über Pipettierzellen und Medien innerhalb der Chips¹². NSCs sind zerbrechlicher als murine Neuronen, so muss sanfter behandelt werden. Es ist auch wichtig, die Stammzellen gründlich zu mischen, bevor sie plattieren, indem Sie sie sanft nach oben und unten pipetieren.

Die Verwendung von Neuronen aus in vitro differenzierten menschlichen Stammzellen wird in Medizin und Forschung immer beliebter. Diese Neuronen sind wichtig für die Forschung und klinische Anwendungen für viele ZNS-Erkrankungen, einschließlich neurodegenerative Erkrankungen und traumatische Hirnverletzungen. Diese Neuronen ähneln den menschlichen fetalen Neuronen¹⁵. In Zukunft könnten entsprechend gealterte Neuronen aus Stammzellen erzeugt werden, um die altersbedingte neuronale Funktion nachzuahmen und in Verbindung mit diesen abgeschotteten Geräten zu verwenden. Diese Geräte werden die Erforschung von Krankheiten erleichtern, die die Gesundheit und Funktion des Axons beeinträchtigen, wie z. B. Axondefizite in Neuronen von Patienten, bei denen Autismus-Spektrum-Störungen diagnostiziert wurden, und axonale Regeneration nach Verletzung^16,17.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor hydrazide 488	ThermoFisher Scientific	A10436
Alexa Fluor secondary antibodies	ThermoFisher Scientific		1:1000
anti_beta-tubulin III	Aves	TUJ	1:1000
anti-vGAT antibody	Synaptic Systems	131 003	1:1000
anti-vGlut1 antibody	NeuroMab	75-066	clone N28/9, 1:100
complete neural stem cell media:
REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM)	ThermoFisher Scientific	PHG0314	20ng/mL
REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM)	ThermoFisher Scientific	PHG0024	20ng/mL
GlutaMAX Supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	35050061	2mM
KnockOut DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12660012
StemPro Neural Supplement	ThermoFisher Scientific	A1050801	2%
Epifluorescence imaging system	EVOS Fluorescence imaging system	AMF4300	10x objective
fluorinated ethylene propylene film	American Durafilm	50A	0.5 mil thickness
Fluoromount G	ThermoFisher Scientific	00-4958-02
Gibco DPBS without Calcium and Magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT	Gibco	N7800200
Gibco Laminin	ThermoFisher Scientific	23017015
Glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA	5.75 in length
H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML	ThermoFisher Scientific	510088
hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Incubator, 5% CO2 37 °C
Laser scanning confocal imaging system	Olympus	FV3000RS	30x silicone oil objective
modified rabies virus	Salk Institute for Biological Studies	G-deleted Rabies-eGFP	Material Transfer Agreement required
Mr. Frosty	ThermoFisher Scientific	5100-0001
Neural differentiation media			Per 100 mL.
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermoFisher Scientific	15240112	1mL (100X)
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	A8960	200mM
BDNF	ThermoFisher Scientific	PHC7074	40 ng/mL
Gibco B27 Plus Supplement (50X)	FisherScientific	A3582801	2mL (50X)
Gibco CultureOne Supplement (100X)	FisherScientific	A3320201	1mL (100X)
Gibco Neurobasal Plus Medium	FisherScientific	A3582901
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	ThermoFisher Scientific	A1110501
Taylor Wharton Liquid N2 dewar	FisherScientific	20HCB11M
triton X-100	ThermoFisher Scientific	28314
XC pre-coat	Xona Microfluidics, LLC	XC Pre-Coat	included with XonaChips
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC450	450 µm length microgroove barrier
Humidifier Tray	Xona Microfluidics, LLC	humidifier tray