Reinigung und Transplantation von myogen Progenitor Cell abgeleitet Exosomen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Duchenne muskulöse dystrophischen Mäusen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um vorübergehend verbessern Herzfunktion bei Duchenne-Muskeldystrophie Mäusen durch die Transplantation von Exosomen von normalen myogen Vorläuferzellen abgeleitet.

Zusammenfassung

Duchene Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessive genetische Krankheit verursacht durch einen Mangel an funktionalen Dystrophin-Protein. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, und wenn die Krankheit fortschreitet, entwickelt der Patient Symptome einer dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz. Die DMD^MDX mutierte Mäuse Dystrophin nicht ausdrücklich und werden häufig als ein Maus-Modell der DMD verwendet. In unserer aktuellen Studie beobachteten wir, dass Intramyocardial Injektion von breite Ausführung (WT)-myogen Progenitor Zellen abgeleitet Exosomen (MPC-Exo) vorübergehend restauriert die Expression von Dystrophin im Myokard von DMD^MDX mutierten Mäusen, die verbunden WT-MPC-Exo kann eine vorübergehende Verbesserung der Herzfunktion, die darauf hindeutet, dass eine Option, um die kardiale Symptome von DMD zur Verfügung. Dieser Artikel beschreibt die Technik der MPC-Exo-Reinigung und Transplantation in Herzen von DMD^MDX mutierten Mäusen.

Einleitung

Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessiv, progressive neuromuskuläre Erkrankungen verursacht durch eine Mutation in DMD gen und den Verlust der funktionellen Dystrophin-¹. Dystrophin drückt sich vor allem im Skelettmuskel und Myokard und weniger drückt sich in endokrinen Drüsen, glatte Muskulatur und Neuronen^2,3. DMD ist die häufigste Form der Muskeldystrophie mit einer Inzidenz von 1 pro 3.500 bis 5.000 Neugeborenen jungen weltweit^4,5. Menschen entwickeln in der Regel progressive Muskelentspannung Nekrose, Verlust des unabhängigen Gehens von frühen Jugend und Tod in der zweiten bis dritten Jahrzehnte ihres Lebens durch Herzversagen und Atemstillstand⁶.

Dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz sind gemeinsame kardiovaskuläre Manifestationen von DMD^7,8. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, unterstützende Behandlung kann Symptome verbessern oder das Fortschreiten der Herzinsuffizienz zu verzögern, aber es ist sehr schwierig, die Herz-Funktion^9,10zu verbessern.

Ähnlich wie bei DMD-Patienten, X-chromosomale Muskeldystrophie (MDX) Mäuse haben einen Mangel an Dystrophin-Protein und vorliegenden Symptome einer Kardiomyopathie¹¹und werden daher häufig in DMD verbundenen Kardiomyopathie Forschung eingesetzt. Um das Dystrophin in den betroffenen Muskeln wiederherzustellen, erweist allogene Stammzell-Therapie sich eine wirksame Behandlung für DMD^12,13,14. Exosomen, 30-150 nm Membranvesikel abgesondert von verschiedenen Zelltypen, spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation durch genetische Materialtransport wie Boten-RNA (mRNA) und nicht-kodierende RNAs^{15,16,17 ,18,19,20,21}.

Unsere frühere Studien haben gezeigt, dass Exosomen abgeleitet myogen Vorläuferzellen (MPC), wie z. B. C2C12 Zelllinie Dystrophin übertragen können mRNA zu Host Kardiomyozyten nach kardialen Direkteinspritzung²², darauf hinweist, dass die allogene Lieferung von MPC-abgeleitete Exosomen (MPC-Exo) können vorübergehend DMD Genexpression in MDX-Mäuse wiederherstellen. Dieser Artikel konzentriert sich auf MPC-Exo-Reinigung und Transplantation-Techniken.

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Protokoll

Tiere wurden entsprechend zugelassene Protokolle und Tierschutzvorschriften der institutionellen Animal Care and Use Committee des Medical College of Georgia Augusta Universität behandelt.

1. Isolierung und Reinigung der MPC-abgeleitete Exosomen

1. Samen 5 x 10⁶ C2C12 Zellen in der Kulturschale 15 cm Zelle mit 20 mL komplette Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin G und 100 μg/mL Streptomycin. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂.
2. 18 h bei 4 ° C mit einem schwingenden Eimer Rotor bereiten Sie Exosom erschöpft Medium durch Ultrazentrifugation der FBS bei 100.000 X g vor . Entsorgen Sie das Pellet.
3. Ersetzen Sie die komplette DMEM mit Exosom erschöpft Medium, wenn Monolage Zellen 80 % Zusammenfluss in der Kulturschale zu erreichen.
4. Verwenden Sie ein Transferpipette, um den Überstand von der Zelle Kulturschale alle 48 h für insgesamt drei Mal zu sammeln. Sammeln des Überstands in 50 mL Zentrifuge Tuben und Zentrifuge bei 150 X g für 10 min in die restlichen Zellen zu entfernen.
5. Filtern des Überstands durch einen 0,22-μm-Filter Zelle Trümmer zu beseitigen. Ultrazentrifugen der gefilterten Medium in ultra-klare Röhrchen mit der schwingenden Eimer-Rotor bei 100.000 X g 120 min bei 4 ° C, Exosomen auszufällen.
6. Aufschwemmen Sie Exosom-haltigen Pellet in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und füllen Sie das gesamte ultra-klare Rohr mit PBS. Führen Sie Ultrazentrifugation dieser Suspension bei 100.000 X g für 120 min bei 4 ° C, kontaminierende Proteine zu beseitigen.
7. Den Überstand verwerfen und das Exosom Pellet in 100 µL PBS Aufschwemmen. Bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
8. 3 µL Exosomal Suspension Platz für Elektronenmikroskopie Analyse auf einem 200 Mesh Formvar beschichteten Kupfer Elektronenmikroskop Raster für 5 min bei Raumtemperatur. Fahren Sie mit standard Uranyl Acetat Färbung²³. Untersuchen Sie die halbtrockene Raster, indem Transmissions-Elektronenmikroskopie.

2. Intramyocardial Exosom Lieferung

Hinweis: Wir haben sechs Mäuse in jeder Gruppe.

1. Betäuben Sie DBA/2J-DMD^MDX -Mäuse (männlich, > 10 Monate Alter, Körpergewicht (BW) > 18 g) mit intraperitoneal (i.p.) Injektion von 100 mg/kg BW von Ketamin in Kombination mit 10 mg/kg BW Xylazin zu, und bestätigen Sie die Tiefe der Narkose durch Zeh kneifen.
2. Jede Maus in Rückenlage auf einer chirurgische Plattform zu beheben, mit Klebeband sichern jede Extremität und legen Sie eine 3: 0-Naht horizontal unterhalb der oberen Zähne Oberkiefer in Position gehalten.
3. Wenden Sie die Enthaarungscreme auf der linken Seite der Maus Brust, das Fell von der Haut zu entfernen.
4. Endotracheale Intubation über Mundhöhle mit einem 24 G Katheter durchführen, und lüften Sie die Maus mit Raumluft mit einer Rate von 195 Atemzüge/min mit einem Nagetier Ventilator (siehe die Tabelle der Materialien).
5. Desinfizieren Sie die Haut mit 75 % Alkohol und 10 % Povidon-Jod.
6. Machen Sie einen 10\u201215 mm schrägen Schnitt vom linken sternale Rand um die linke Achselhöhle, schneiden Sie großen Pectoralis und Pectoralis minor mit einer Schere, dann eine linke Thorakotomie durch den vierten Intercostalneuralgie Raum. Fügen Sie sanft die Aufrollvorrichtung Bands um die Brusthöhle auf eine breite von 10 mm zu verbreiten. Achten Sie darauf, um die linke Lunge Schaden zu vermeiden.
7. Verwenden Sie zwei gerade Pinzette entfernen das Perikard, auseinander ziehen und legen Sie sie hinter die Aufrollvorrichtung Tipps, um das Herz aussetzen. MPC-Exo zu injizieren (50 μg in 30 µL PBS) oder 30 μl PBS (als Kontrolle) Intramyocardially in der vorderen Wand des linken Ventrikels mit einer 31 G-Insulin-Nadel an einem Standort.
8. Verwenden Sie 6-0-Nylon-Fäden um die Brusthöhle, Pectoralis Muskeln und Haut in Reihenfolge zu schließen.
9. Mäuse zu erholen. Nachdem rhythmische, spontane Atmung vorhanden ist, entfernen Sie die Mäuse aus den Ventilator und Extubate. Beobachten Sie und notieren Sie die Mäuse Zustand nach der Operation.

(3) Echokardiographie

Hinweis: Ein einzelner Beobachter zu den Versuchsgruppen geblendet führt Echokardiographie und Datenanalyse.

1. Betäuben Sie zwei Tage nach der Transplantation PBS/Exosom, die Mäuse mit 1\u20122% Isoflurane.
2. Fixieren Sie eine Maus in Rückenlage mit Klebeband, und tragen Sie das vorgewärmte akustische Gel auf den linken Brustbereich.
3. Bewerten Sie linken ventricular Funktion durch Echokardiographie, wie zuvor beschrieben^16,24.
   1. Die Parasternal lange Achse Übersicht über dem linken Ventrikel (LV) in zwei Dimensionen (B-Modus), und dann die Ultraschallsonde 90° drehen, um eine LV kurze Achse papillären Muskel Ebene zu erhalten.
   2. M-Modus echokardiographischen Bilder und links ventrikulären End-diastolischen Durchmesser messen (LVEDD), linken ventricular Ende systolischen Volumen (LVESD) linken ventricular End-diastolischen Volumen (LVEDV) und linken ventricular Ende systolischen Volumen (LVESV).
      Hinweis: Gebrochene Verkürzung (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] X 100 und linken linksventrikulären Auswurffraktion (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] X 100.

4. Immunhistochemie

1. Zwei Tage nach der Transplantation PBS/Exosom, betäuben Sie Mäuse (siehe Punkt 2.1) zu und geschnitten Sie das Brustbein auf, der Brusthöhle verfügbar zu machen. Sezieren Sie der minderwertigen Vena Cava, und Durchspülen Sie das Herz durch den linken Ventrikel Apex mit 3 mL PBS, gefolgt von 3 mL 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur mit einem Schmetterling-Katheter mit einem 25 G Nadel eine 5 mL Spritze.
2. Feste Herzen in Paraffin einbetten, und 5 μm dicke Abschnitte geschnitten.
3. Deparaffinize Folien in Xylol und rehydrieren in Ethanol Lösungen in folgender Reihenfolge: 100 % Xylol (3 min), 100 % Xylol (3 min), 100 % igem Ethanol (1 min), 100 % igem Ethanol (1 min), 95 % igem Ethanol (1 min), 80 % Ethanol (1 min), H₂O (1 min).
4. Gewebeschnitte mit 4 % Paraformaldehyd für 8 min bei Raumtemperatur zu beheben.
5. Folien in Natriumcitrat (0,01 M, pH 6.0) Tauchen und Antigen-Retrieval mit einem Antigen-Retriever durchführen.
6. Permeabilize Abschnitte für 1 h bei Raumtemperatur mit 1 % Polyethylenglykol Tert-Octylphenyl Äther mit PBS-Puffer.
7. Abschnitte mit 5 % Ziegenserum mit PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur zu blockieren.
8. Abschnitte mit verdünnter primären Antikörper (Anti-Dystrophin Antikörper) mit PBS-Puffer (1: 100) über Nacht bei 4 ° C inkubieren, dann 5 min dreimal mit PBS waschen.
9. Inkubieren Sie Abschnitte mit verdünnter Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488 konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG) mit PBS-Puffer (1: 400) für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
10. Autofluoreszenz mit einem Autofluoreszenz abschrecken kit (siehe die Tabelle der Materialien).
11. Verwendung Eindeckmittel mit DAPI (siehe die Tabelle der Materialien), die Folien zu montieren.
12. Folien unter einem confocal Mikroskop zu beobachten.

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Ergebnisse

Ein Flussdiagramm zur Isolierung und Reinigung von Exosomen aus C2C12 Zellen ist in Abbildung 1Adargestellt. Um das Vorhandensein von Exosomen zu bestätigen, haben wir Transmission Electron Microscopy Analyse durchgeführt. Transmission Electron Microscopy Bild (Abbildung 1B) zeigt die Morphologie der Vesikel hell und Runde Form von Exosomen C2C12 abgeleitet. Western-Blot Analyse bestätigte die Anwesenheit von Exosom Markierun...

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Diskussion

Die Methode der reinen Exosomen zu isolieren ist essentiell für die Funktion der Exosomen zu studieren. Eines der gemeinsamen Techniken für die Exosom Isolierung ist Polyethylen Glykole (PEGs) vermittelte Niederschlag^17,18,25. Exosomen können Stifte ausgefällt, und pelleted durch langsame Zentrifugation. PEG-vermittelten Reinigung ist sehr bequem, Low Cost, es braucht keiner vorgerückte Ausrüstung, aber gibt es Bedenken ü...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Filter	Fisherbrand	09-720-004
15 cm Cell Culture Dish	Thermo Fisher Scientific	157150
24 G catheter	TERUMO	SR-OX2419CA
31 G insulin needle	BD	328291
4% paraformaldehyde	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6-0 suture	Pro Advantage by NDC	P420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Antibiotic Antimycotic Solution	Corning	30-004-CI
Anti-Dystrophin antibody	Abcam	ab15277
Antigen retriever	Aptum Biologics	R2100-US	Antigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 cell line	ATCC	CRL-1772
Centrifuge	Unico	C8606
Change-A-Tip High Temp Cauteries	Bovie Medical Corporation	HIT
Confocal microscopy	Zeiss	Zeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx mice	The Jackson Laboratory	013141
DMEM	Corning	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
Goat serum	MP Biomedicals, LLC	191356
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Ketamine	Henry Schein	056344
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Mouse Retractor Set	Kent Scientific	SURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fisher Scientific	BP151-100
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	55-7066
SW-28 Ti rotor	Beckman	342207
The Vevo 2100 Imaging Platform	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100	Ultrasound System
Ultracentrifuge	Beckman	365672
Ultra-Clear Tubes	Beckman	344058
Xylazine (XylaMed)	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006