Purificazione e trapianto di cellule progenitrici Myogenic derivato esosomi per migliorare la funzione cardiaca nei topi distrofici muscolare di Duchenne

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la funzione cardiaca nei topi di distrofia muscolare di Duchenne transitoriamente trapiantando esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic normale.

Abstract

Duchene distrofia muscolare (DMD) è una malattia genetica recessiva legata al X causata da una mancanza di distrofina funzionale. La malattia non può essere curata, e come la malattia progredisce, il paziente sviluppa sintomi di scompenso cardiaco, aritmia e cardiomiopatia dilatativa. I topi mutanti DMD^MDX non esprimono distrofina e sono comunemente usati come un modello murino di DMD. Nel nostro recente studio, abbiamo osservato che l'iniezione intramiocardica di tipo largo (WT)-esosomi derivato da cellule progenitrici myogenic (MPC-Exo) ripristino transitoriamente l'espressione di distrofina nel miocardio dei topi mutanti DMD^MDX , che è stato associato con un miglioramento transitorio nella funzione cardiaca suggerendo che WT-MPC-Exo può fornire un'opzione per alleviare i sintomi cardiaci di DMD. Questo articolo descrive la tecnica di purificazione di MPC-Exo e trapianto nei cuori dei topi mutanti DMD^MDX .

Introduzione

Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una X-linked recessiva neuromuscolare malattia progressiva causata da una mutazione nel gene DMD e la perdita di distrofina funzionale¹. Distrofina è espresso principalmente nel miocardio e nel muscolo scheletrico e meno è espressa nel muscolo liscio, ghiandole endocrine e neuroni^2,3. DMD è il tipo più comune di distrofia muscolare con un'incidenza di uno per 3.500 a 5.000 ragazzi neonato in tutto il mondo^4,5. Gli individui si sviluppano tipicamente necrosi progressiva del muscolo, perdita della deambulazione indipendente dalla prima adolescenza e morte nei decenni della loro vita a causa di scompenso cardiaco e insufficienza respiratoria⁶secondo al terzo.

Cardiomiopatia dilatativa, aritmie e scompenso cardiaco sono manifestazioni comuni cardiovascolare di DMD^7,8. La malattia non può essere curata, trattamento di supporto può migliorare i sintomi o ritardare la progressione dell'insufficienza cardiaca, ma è molto difficile migliorare il cuore funzione^9,10.

Simile ai pazienti di DMD, distrofia muscolare X-collegata (MDX) topi sono carenti di distrofina e presenti sintomi di cardiomiopatia¹¹e di conseguenza sono ampiamente usati nella DMD associata cardiomiopatia ricerca. Al fine di ripristinare la distrofina in muscoli commoventi, terapia di trapianto allogeneic della cellula formativa ha dimostrato di essere un efficace trattamento per DMD^12,13,14. Esosomi, vescicole di membrana di 30-150 nm secernute da vari tipi cellulari, svolgono un ruolo chiave nella comunicazione cellula--cellula attraverso il trasporto di materiale genetico, come RNA messaggero (mRNA) e non-codificazione RNAs^{15,16,17 ,18,19,20,21}.

Nostri studi precedenti hanno dimostrato che gli esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic (MPC), ad esempio linea di cellule C2C12, possono trasferire dystrophin mRNA a host cardiomiociti dopo iniezione cardiaca diretta²², che indica quella consegna allogenico di MPC-derivato esosomi (MPC-Exo) possono ripristinare transitoriamente DMD espressione genica nei topi MDX. Questo articolo si concentra su tecniche di purificazione e trapianto di MPC-Exo.

Protocollo

Gli animali sono stati gestiti secondo protocolli approvati e le norme sul benessere degli animali del Comitato uso il Medical College della Georgia all'Università di Augusta e istituzionali Animal Care.

1. isolamento e purificazione di esosomi MPC-derivato

1. Seme 5 x 10⁶ C2C12 celle in una piastra di coltura cellulare di 15cm con 20ml completo Dulbecco modificate, mezzo di Eagle (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina. Incubare a 37 ° C e 5% CO₂.
2. Preparare il supporto di esosomi-vuotati dall'ultracentrifugazione di FBS a 100.000 x g per 18 ore a 4 ° C, utilizzando un rotore oscillante. Scartare il pellet.
3. Sostituire il DMEM completo con esosomi-vuotati medio quando le cellule dello strato monomolecolare raggiungono 80% confluenza nella piastra di coltura.
4. Utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere il surnatante da piastra di coltura cellulare ogni 48 h per un totale di tre volte. Raccogliere il surnatante in provette centrifuga da 50 mL e centrifugare a 150 x g per 10 min rimuovere le cellule rimanenti.
5. Filtrare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 μm per eliminare i detriti cellulari. Ultracentrifuga il mezzo filtrato in ultra-chiari tubi utilizzando il rotore oscillante a 100.000 x g per 120 min a 4 ° C per precipitare esosomi.
6. Risospendere il pellet contenente esosomi in tampone fosfato salino (PBS) e riempire l'intero tubo ultra-trasparente con PBS. Eseguire ultracentrifugazione di questa sospensione a 100.000 x g per 120 min a 4 ° C per eliminare le proteine contaminanti.
7. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet di esosomi in 100 µ l PBS. Conservare a-80 ° C per un uso futuro.
8. Per analisi di microscopia elettronica, posto 3 µ l di sospensione exosomal su una griglia di formvar-rivestito rame microscopio elettronico 200 mesh per 5 min a temperatura ambiente. Continuare con acetato di uranile standard colorazione²³. Esaminare la griglia semi-secca di microscopia elettronica di trasmissione.

2. intramiocardico esosomi consegna

Nota: Abbiamo usato i sei topi in ogni gruppo.

1. Anestetizzare topi DBA/2J-DMD^MDX (maschio; età > 10 mesi; peso corporeo (BW) > 18 g) con l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di 100 mg/kg BW di ketamina combinato con 10 mg/kg BW di xilazina e confermare la profondità dell'anestesia con pizzico di punta.
2. Difficoltà ogni mouse in posizione supina su una piattaforma chirurgica utilizzando nastro per fissare ogni arto e collocare una sutura 3-0 orizzontalmente sotto i denti superiori per tenere la mascella superiore in posizione.
3. Applicare la crema depilatoria sul lato sinistro del petto del mouse per rimuovere il pelo dalla pelle.
4. Eseguire l'intubazione endotracheale tramite cavità orale utilizzando un catetere 24G e ventilare il mouse con l'aria ambiente a una velocità di 195 respiri/min utilizzando un ventilatore del roditore (Vedi la Tabella materiali).
5. Disinfettare la pelle con alcool di 75% e 10% povidone iodio.
6. Fare una 10\u201215 incisione obliqua mm dal bordo sternale sinistro per l'ascella sinistra, tagliato il pettorale e il pettorale minore di una forbice, poi fare un thoracotomy di sinistra attraverso il quarto spazio intercostale. Inserire delicatamente le bande di riavvolgitore per diffondere la cavità toracica ad una larghezza di 10 mm. Prestare attenzione per evitare danni al polmone sinistro.
7. Utilizzare due dritto pinzette per rimuovere il pericardio, li separano e metterli dietro le punte del divaricatore per esporre il cuore. Iniettare MPC-Exo (50 μg in 30 µ l PBS) o 30 μL PBS (come controllo) intramyocardially nella parete anteriore del ventricolo sinistro usando un ago da insulina 31G presso un unico sito.
8. Utilizzare suture in nylon 6-0 per chiudere la cavità toracica, muscoli pettorali e la pelle in sequenza.
9. Recuperare i topi. Una volta che la respirazione ritmica, spontanea è presente, è possibile rimuovere i topi dal ventilatore ed estubare. Osservare e registrare la condizione di topi dopo l'intervento chirurgico.

3. l'ecocardiografia

Nota: Un singolo osservatore cieco per i gruppi sperimentali esegue ecocardiografia e analisi dei dati.

1. Due giorni dopo il trapianto di PBS/esosomi, anestetizzare i topi con isoflurano 1\u20122%.
2. Difficoltà un mouse in posizione supina usando del nastro e applicare il gel acustico preriscaldato sulla zona sinistra del petto.
3. Valutare la funzione ventricolare di sinistra da ecocardiografia come precedentemente descritto^16,24.
   1. Ottenere la visualizzazione di parasternale asse lungo del ventricolo sinistro (LV) in due dimensioni (modalità B) e quindi ruotare la sonda ad ultrasuoni 90° per ottenere una visione di breve-asse di LV a livello del muscolo papillare.
   2. Registrare le immagini ecocardiografiche M-mode e misura diametro in fine-diastolica ventricolare sinistra (LVEDD), volume telesistolico ventricolare sinistro (LVESD), volume end-diastolic ventricolare sinistra (LVEDV) e il volume telesistolico ventricolare sinistro (LVESV).
      Nota: Riduzione frazionaria (% FS) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 e frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.

4. Immunohistochemistry

1. Due giorni dopo il trapianto di PBS/esosomi, anestetizzare topi (Vedi punto 2.1) e tagliare lo sterno aperto per esporre la cavità toracica. Sezionare la vena cava inferiore e irrorare il cuore attraverso l'apice del ventricolo sinistro con 3 mL di PBS, seguita da 3 mL di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente, utilizzando un catetere di farfalla con un ago 25 G collegato ad una siringa da 5 mL.
2. Incorpora cuori fissi in paraffina e tagliati in sezioni spesse di 5 μm.
3. Deparaffinizzare xilene e reidratare in soluzioni di etanolo nel seguente ordine: 100% xilene (3 min), 100% xilene (3 min), etanolo al 100% (1 min), etanolo al 100% (1 min), etanolo al 95% (1 min), 80% di etanolo (1 min), H₂O (1 min).
4. Difficoltà sezioni di tessuto con paraformaldeide al 4% per 8 min a temperatura ambiente.
5. Immergere i vetrini in citrato di sodio (0,01 M, pH 6.0) ed eseguire il ricupero dell'antigene utilizzando un documentalista di antigene.
6. Permeabilize sezioni per 1 h a temperatura ambiente con 1% polietilene glicole etere tert-octylphenyl in PBS.
7. Bloccare le sezioni con siero di capra del 5% in PBS per 1 h a temperatura ambiente.
8. Incubare le sezioni con l'anticorpo primario diluito (anticorpo anti-distrofina) in PBS (1: 100) durante la notte a 4 ° C, quindi lavare tre volte con PBS per 5 min.
9. Incubare le sezioni con anticorpo secondario diluito (Alexa Fluor 488 coniugato anti-coniglio di capra IgG) in PBS (1: 400) per 45 min a temperatura ambiente.
10. Controllo autofluorescence utilizzando un'autofluorescenza tempra kit (vedere la Tabella materiali).
11. Mezzo di montaggio uso contenente DAPI (Vedi la Tabella materiali) per montare le diapositive.
12. Osservare vetrini al microscopio confocale.

Risultati

Un diagramma di flusso per isolare e purificare gli esosomi da cellule C2C12 è illustrato nella Figura 1A. Per confermare la presenza di esosomi, abbiamo effettuato l'analisi di microscopia elettronica di trasmissione. Immagine di microscopia elettronica di trasmissione (Figura 1B) Mostra la morfologia delle vescicole di forma rotonda e brillante degli esosomi C2C12 derivato. L'analisi Western blot ha confermato la presenza di ...

Discussione

Il metodo di isolamento esosomi puri è essenziale per studiare la funzione di esosomi. Una delle tecniche comuni per l'isolamento di esosomi è polietilenglicoli (pioli) mediate precipitazioni^17,18,25. Esosomi possono essere precipitati in pioli e pellettati mediante centrifugazione a bassa velocità. PEG-mediata di purificazione è molto conveniente, basso costo, non ha bisogno di qualsiasi attrezzatura avanzata, ma c'è preoc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Filter	Fisherbrand	09-720-004
15 cm Cell Culture Dish	Thermo Fisher Scientific	157150
24 G catheter	TERUMO	SR-OX2419CA
31 G insulin needle	BD	328291
4% paraformaldehyde	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6-0 suture	Pro Advantage by NDC	P420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Antibiotic Antimycotic Solution	Corning	30-004-CI
Anti-Dystrophin antibody	Abcam	ab15277
Antigen retriever	Aptum Biologics	R2100-US	Antigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 cell line	ATCC	CRL-1772
Centrifuge	Unico	C8606
Change-A-Tip High Temp Cauteries	Bovie Medical Corporation	HIT
Confocal microscopy	Zeiss	Zeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx mice	The Jackson Laboratory	013141
DMEM	Corning	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
Goat serum	MP Biomedicals, LLC	191356
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Ketamine	Henry Schein	056344
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Mouse Retractor Set	Kent Scientific	SURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fisher Scientific	BP151-100
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	55-7066
SW-28 Ti rotor	Beckman	342207
The Vevo 2100 Imaging Platform	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100	Ultrasound System
Ultracentrifuge	Beckman	365672
Ultra-Clear Tubes	Beckman	344058
Xylazine (XylaMed)	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006