정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 Dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 Exosomes

요약

여기, 선물이 정도 정상 조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes를 이식 하 여 듀 켄 씨 근이 영양 증 쥐에 심장 기능을 개선 하는 프로토콜.

초록

Duchene 근 위축 증 (DMD)은 X 연결 된 열성 유전 질환 기능 dystrophin 단백질 부족으로 인 한. 질병을 치료 수 없습니다, 그리고 및 질병 진행 되는 동안, 환자는 동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥, 울 혈 심장 마비의 증상을 개발 합니다. DMD^MDX 돌연변이 마우스 dystrophin, 표현 하지 않는 그리고의 DMD 쥐 모형으로 일반적으로 사용 됩니다. 우리의 최근 연구에서 그 intramyocardial 주입 와이드 타입 (WT)의 관찰-조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes (MPC-엑 소) 정도 연관 되었다 dystrophin DMD^MDX 돌연변이 생쥐의 심근에서의 식을 복원 심장 기능을 제안에 일시적인 개선 WT-MPC-엑 소 DMD의 심장 증상을 완화 하는 옵션을 제공할 수 있습니다. 이 문서에서는 MPC-엑 소 정화 및 DMD^MDX 돌연변이 생쥐의 마음에 이식 하는 기술을 설명합니다.

서문

듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD)은 X 연결 된 열성, 진보적인 신경 근육 학 질환 기능 dystrophin¹의 손실과 DMD 유전자에 돌연변이 의해 발생. Dystrophin 골격 근육에 심근, 주로 표현 하 고 덜 부드러운 근육, 내 분 비 샘과 신경^2,3에 표시 됩니다. DMD는 3500 5000 신생아 소년 전세계^4,5에 하나씩의 발생률과 근 위축 증의 가장 일반적인 유형입니다. 개인은 일반적으로 진보적인 근육 괴 사, 손실 초기 청소년 기, 그리고 두 번째 제 3 년간 심장 마비 및 호흡⁶그들의 생활의 죽음에의 한 독립적인 지나가는의 개발.

동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥 및 심부는 DMD^7,8의 일반적인 심장 혈관 발현. 질병을 치료 수 없습니다, 지지 치료 증상을 향상 시킬 수 있습니다 또는 심장 마비의 진행을 지연 하지만 심장 기능^9,10개선 하기는 매우 어렵습니다.

DMD 환자, X 연결 된 근이 영양 증과 유사한 (MDX) 마우스 dystrophin 단백질 및 심근¹¹의 현재 증상에 결핍을 따라서 널리 관련 된 DMD 심근 연구에 사용 합니다. 영향을 받는 근육에 dystrophin 복원 하기 위해 수용자 줄기 세포 치료는 DMD^12,,1314에 대 한 효과적인 치료로 입증 되었습니다. Exosomes, 30-150 nm 막 소포 다양 한 셀 형식에 의해 은닉 된다 메신저 RNA (mRNA) 등 비 코딩 RNAs^{15,16,17 유전 소재 전송을 통해 셀을 통신에 핵심적인 역할을 담당 ,,1819,,2021}.

우리의 이전 연구 C2C12 셀 줄, 조직적 뿌리 세포 (MPC)에서 파생 된 exosomes dystrophin 전송할 수 있습니다 직접 심장 주입²², 후 호스트 cardiomyocytes에 mRNA의 배달 된 수용자를 나타내는 MPC 파생 된 exosomes (MPC-엑 소) 정도 MDX 쥐에 DMD 유전자 발현을 복원할 수 있습니다. 이 문서는 MPC-엑 소 정화 및 이식 기술에 초점을 맞추고.

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프로토콜

동물은 승인 된 프로토콜 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 오 거 스타 대학에서 조오지 아의 의학 대학의의 동물 복지 규정에 따라 처리 합니다.

1. 격리와 MPC에서 파생 된 Exosomes의 정화

1. 20 mL 완전 한 Dulbecco와 15 cm 세포 문화 접시에 시드 5 x 10⁶ C2C12 셀이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 G 및 100 μ g/mL 스 수정. 37 ° C, 5% CO₂에서 품 어.
2. 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에 18 h에 대 한 100000 x g 에서 FBS의 ultracentrifugation에 의해 exosome 고갈 매체를 준비 합니다. 펠 릿을 삭제 합니다.
3. 단층 세포 문화 접시에 80%의 합류를 도달할 때 완전 한 DMEM 매체 exosome 고갈 대체.
4. 전송 피 펫을 사용 하 여 셀 문화 접시 총 3 번에 대 한 모든 48 h에서에서는 상쾌한 수집. 50 mL 원심 분리기 튜브, 그리고 나머지 셀을 제거 하려면 10 분 동안 150 x g 에서 원심 분리기에 상쾌한을 수집 합니다.
5. 상쾌한 세포 파편을 제거 하는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링. Ultracentrifuge exosomes 침전 하 4 ° C에서 120 분 100000 x g 에서 진동 물통 회전자를 사용 하는 매우 명확한 튜브에 필터링 된 매체.
6. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 exosome 포함 된 펠 릿을 resuspend 하 고 PBS를 가진 전체 매우 명확한 튜브를 입력 합니다. 오염 단백질 제거 하 4 ° C에서 120 분 100000 x g 에이 서 스 펜이 션의 ultracentrifugation를 수행 합니다.
7. 삭제는 상쾌한 고 100 µ L PBS에 exosome 펠 릿 resuspend. 나중에 사용-80 ° C에 저장 합니다.
8. 전자 현미경 분석, 실 온에서 5 분 동안 200 메쉬 구리 전자 현미경 formvar 코팅 그리드에서 3 µ L exosomal 현 탁 액의 장소. 표준 uranyl 아세테이트²³얼룩이 계속 합니다. 세미 드라이 그리드 전송 전자 현미경으로 검사 합니다.

2. Intramyocardial Exosome 배달

참고: 우리는 각 그룹에 6 쥐를 사용합니다.

1. 100 mg/kg BW 케 타 민 10 mg/kg BW xylazine의 함께의 복 (i.p.) 주입으로 DBA/2J-DMD^MDX 쥐 (남자 > 10 개월, 몸 무게 (BW) > 18 g) anesthetize 고 발가락 핀치에 의해 마 취의 깊이 확인 합니다.
2. 각 다리를 확보 하 니 자리에 위 턱을 아래 수평으로 3-0 봉합 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼에 부정사 위치에 각 마우스를 수정.
3. 피부에서 모피를 제거 하려면 마우스 가슴의 왼쪽을 depilatory 크림을 적용 합니다.
4. 24 G 카 테 터를 사용 하 여 구강을 통해 endotracheal 삽 관 법을 수행 하 고 마우스 설치류 호흡을 사용 하 여 195 호흡/min의 속도로 방 공기를 환기 ( 재료의 표참조).
5. 75% 알코올과 10 %povidone 요오드와 함께 피부를 소독.
6. 10\u201215 m m 경사 절 개를 왼쪽된 sternal 가장자리에서 왼쪽된 겨드랑이를 확인, 주요 흘리는 pectoralis 미성년자는 시저에 의해 잘라 다음 왼쪽된 thoracotomy 4 있는 공간을 통해 합니다. 부드럽게 확산 10 m m의 폭을 흉 강 견인 밴드 삽입 합니다. 왼쪽된 폐에 손상을 입히지 않도록 주의 하십시오.
7. 두 직선 핀셋을 사용 하 여 심 낭 제거, 떨어져, 그들을 끌어 및 노출 심장 견인 팁 뒤에 그들을 배치. MPC-엑 소 주사 (30 µ L PBS에서 50 μ g) 또는 31 G 인슐린 바늘을 사용 하 여 한 사이트에서 좌 심 실의 앞쪽 벽에 30 μ PBS (컨트롤로) intramyocardially.
8. 6-0 나일론 봉합을 사용 하 여 시퀀스에서 흉 강, pectoralis 근육과 피부를 닫습니다.
9. 마우스를 복구 합니다. 리듬, 자발적인 호흡이 있으면 일단 호흡, 그리고 extubate에서 쥐를 제거 합니다. 관찰 하 고 수술 후 마우스 상태를 기록 합니다.

3입니다. 심장 초음파

참고: 실험적인 그룹에 눈을 멀게 한 관찰자는 심장 초음파 및 데이터 분석을 수행 합니다.

1. PBS/exosome 이식 후 2 일 anesthetize 1\u20122% isoflurane와 쥐.
2. 테이프를 사용 하 여 부정사 위치에 마우스를 해결 하 고 따뜻한 어쿠스틱 젤 왼쪽된 가슴 지역에 적용.
3. 앞에서 설명한^16,24로 심장 초음파로 좌 심 실 기능을 평가 합니다.
   1. 2 차원 (B 모드), 좌 심 실 (LV)의 parasternal 긴 축 보기를 얻을 하 고 젖꼭지 근육 수준에서 LV 짧은 축 보기를 얻기 위해 초음파 프로브 90 °를 회전.
   2. 기록 M 모드 echocardiographic 이미지와 왼쪽된 심 실 끝 심장 확장 지름 측정 (LVEDD), 왼쪽된 심 실 끝 심장 수축 볼륨 (LVESD), 좌 심 실 끝 심장 확장 볼륨 (LVEDV), 및 좌 심 실 끝 심장 수축 볼륨 (LVESV)
      참고: 분수 단축 (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100, 및 좌 심 실 방출 분 율 (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.

4입니다. Immunohistochemistry

1. PBS/exosome 이식 후 2 일 anesthetize 마우스 (단계 2.1 참조) 하 고 흉 골 흉 강 폭로 자르면. 열 등 한 베 나 정 맥, 해 부하 고 3 mL PBS, 뒤에 실 온에서 4% paraformaldehyde 3 mL 5 mL 주사기에 부착 된 25 G 바늘으로 나비 카 테 터를 사용 하 여와 좌 심 실 정점 통해 심장 perfuse.
2. 파라핀에 고정된 마음을 포함 하 고 5 μ m 두꺼운 부분으로 잘라.
3. 크 실 렌에 슬라이드 deparaffinize 하 고 다음 순서에 따라 에탄올 솔루션에 리하이드레이션: 100% 크 실 렌 (3 분), 100% 크 실 렌 (3 분), 100% 에탄올 (1 분), 100% 에탄올 (1 분), 95% 에탄올 (1 분), 80% 에탄올 (1 분), H₂O (1 분).
4. 실 온에서 8 분 4 %paraformaldehyde 조직 단면도 수정 합니다.
5. 나트륨 구 연산 염 (0.01 M, pH 6.0)에서 슬라이드를 담가 그리고 항 원 검색기를 사용 하 여 항 원 검색을 수행.
6. PBS에서 1% 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르와 실 온에서 1 h 섹션 permeabilize
7. 5% 염소 혈 청 PBS에 실 온에서 1 h에 대 한 섹션을 차단 합니다.
8. 희석된 1 차적인 항 체 (항 체 안티 dystrophin) PBS (1: 100)에 4 ° C에서 하룻밤 섹션을 품 어 다음 5 분 동안 세 번 PBS로 세척.
9. 희석된 이차 항 체 (알 렉 사 Fluor 488 활용 염소-토끼 IgG) PBS (1:400)에 상 온에서 45 분에 대 한 섹션을 품 어.
10. 제어 autofluorescence ( 테이블의 자료를 참조) 키트는 냉각 하는 autofluorescence 사용 하 여.
11. 사용 설치 매체 DAPI 포함 된 슬라이드 마운트 (참조 테이블의 자료).
12. Confocal 현미경 슬라이드를 관찰 합니다.

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결과

분리 하 고 순화 C2C12 세포에서 exosomes에 대 한 흐름 차트는 그림 1에 표시 됩니다. Exosomes의 존재를 확인, 우리는 전송 전자 현미경 분석을 수행. 전송 전자 현미경 이미지 (그림 1B) 파생 하는 C2C12 exosomes의 밝고 둥근 모양 vesicles의 형태를 보여 줍니다. 서쪽 오 점 분석 exosome 마커, CD63 및 TSG101 등의 존재를 확인 했다 (

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토론

순수한 exosomes를 분리 하는 방법은 exosomes의 기능을 공부에 대 한 필수적입니다. Exosome 격리에 대 한 일반적인 기술 중 하나는 폴 리 에틸렌 glycols (나무 못) 중재 강수량^17,18,25입니다. Exosomes, 구슬에서 시 켰 던 고 저속 원심 분리에 의해 일지도. 못-중재 정화는 매우 편리 하 고, 낮은-비용, 어떤 고급 장비를 필요 하지 않습니다 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Filter	Fisherbrand	09-720-004
15 cm Cell Culture Dish	Thermo Fisher Scientific	157150
24 G catheter	TERUMO	SR-OX2419CA
31 G insulin needle	BD	328291
4% paraformaldehyde	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6-0 suture	Pro Advantage by NDC	P420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Antibiotic Antimycotic Solution	Corning	30-004-CI
Anti-Dystrophin antibody	Abcam	ab15277
Antigen retriever	Aptum Biologics	R2100-US	Antigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 cell line	ATCC	CRL-1772
Centrifuge	Unico	C8606
Change-A-Tip High Temp Cauteries	Bovie Medical Corporation	HIT
Confocal microscopy	Zeiss	Zeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx mice	The Jackson Laboratory	013141
DMEM	Corning	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
Goat serum	MP Biomedicals, LLC	191356
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Ketamine	Henry Schein	056344
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Mouse Retractor Set	Kent Scientific	SURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fisher Scientific	BP151-100
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	55-7066
SW-28 Ti rotor	Beckman	342207
The Vevo 2100 Imaging Platform	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100	Ultrasound System
Ultracentrifuge	Beckman	365672
Ultra-Clear Tubes	Beckman	344058
Xylazine (XylaMed)	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006