Purificação e transplante de células progenitoras miogênico derivado Exosomes para melhorar a função cardíaca em camundongos distróficos Muscular de Duchenne

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar a função cardíaca em camundongos de distrofia muscular de Duchenne transitoriamente transplantando exosomes derivado de células progenitoras miogênico normal.

Resumo

Distrofia Muscular Duchene (DMD) é uma doença de genética recessiva ligada ao X causada pela falta da proteína distrofina funcional. A doença não pode ser curada, e como a doença progride, o paciente desenvolve sintomas de insuficiência cardíaca congestiva, arritmia e cardiomiopatia dilatada. Os ratos mutantes DMD^MDX não expressam distrofina e são comumente usados como um modelo do rato da DMD. Em nosso estudo recente, observamos aquela injeção Intramiocárdica do tipo largura (WT)-exosomes de derivado de células progenitoras miogênico (MPC-Exo) restaurado transitoriamente a expressão da distrofina no miocárdio de ratos mutantes DMD^MDX , que foi associado com uma melhoria transitória da função cardíaca, sugerindo que WT-MPC-Exo pode fornecer uma opção para aliviar os sintomas cardíacos de DMD. Este artigo descreve a técnica de purificação de MPC-Exo e transplante em corações de ratos mutantes DMD^MDX .

Introdução

Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma ligada ao X recessiva, progressiva doença neuromuscular causada por uma mutação no gene DMD e a perda de distrofina funcional¹. Distrofina é expressa principalmente no miocárdio e músculo esquelético e manifesta-se menos no músculo liso, glândulas endócrinas e neurônios^2,3. DMD é o tipo mais comum de distrofia muscular, com uma incidência de 1 por 3.500 a 5.000 meninos recém-nascidos em todo o mundo^4,5. Indivíduos normalmente desenvolvem necrose muscular progressiva, perda de andar independente pelo início da adolescência e morte nas décadas de suas vidas devido a insuficiência cardíaca e insuficiência respiratória⁶segundo para terceiro.

Cardiomiopatia dilatada, arritmias e insuficiência cardíaca congestiva são manifestações cardiovasculares comuns de DMD^7,8. A doença não pode ser curada, tratamento de suporte pode melhorar os sintomas ou retardar a progressão da insuficiência cardíaca, mas é muito difícil melhorar a função de coração^9,10.

Semelhante aos pacientes DMD, distrofia ligada ao X (MDX) ratos são deficientes em proteína distrofina e os sintomas de cardiomiopatia¹¹e, portanto, são amplamente utilizados na pesquisa de cardiomiopatia DMD associado. A fim de restaurar a distrofina em músculos afetados, terapia de células-tronco alogênico provou para ser um tratamento eficaz para DMD^12,13,14. Exosomes, 30-150 vesículas de membrana nm secretadas por vários tipos de células, desempenham um papel fundamental na comunicação célula a célula através do transporte de material genético, como o ARN mensageiro (ARNm) e não-codificantes RNAs^{15,16,17 ,18,19,20,21}.

Nossos estudos anteriores mostraram que o exosomes, derivado de células progenitoras miogênico (MPC), tais como linha de celular C2C12, pode transferir distrofina mRNA para anfitrião cardiomyocytes após injeção direta cardíaca²², indicando que entrega alogênico de MPC-derivado exosomes (MPC-Exo) transitoriamente pode restaurar a expressão do gene DMD em camundongos MDX. Este artigo centra-se em técnicas de purificação e transplante de MPC-Exo.

Protocolo

Os animais foram tratados de acordo com protocolos aprovados e normas de bem-estar animal do Comité de utilização da faculdade médica de Geórgia na Universidade de Augusta e institucional Cuidado Animal.

1. isolamento e purificação de MPC-derivado Exosomes

1. Semente de 5 x 10⁶ C2C12 células em um prato de cultura de célula 15 cm com de 20 mL Dulbecco completa modificado médio da águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 de U/mL penicilina G e 100 estreptomicina μg/mL. Incube a 37 ° C e 5% de CO₂.
2. Prepare-se empobrecido exossomo médio por ultracentrifugação de FBS a 100.000 x g por 18 h a 4 ° C, utilizando um rotor de balde oscilante. Descarte a pelota.
3. Substitua o DMEM completo médio exossomo empobrecido quando células monocamadas alcançar 80% de confluência da placa de cultura.
4. Use uma pipeta de transferência para recolher o sobrenadante do prato cultura celular cada 48 h para um total de três vezes. Recolha o sobrenadante em tubos de centrífuga de 50 mL e centrifugar a 150 x g durante 10 minutos remover as células restantes.
5. Filtre o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm para eliminar detritos celulares. Se o meio filtrado em tubos ultra claros usando o rotor balde balançando a 100.000 x g durante 120 minutos a 4 ° C para precipitar exosomes.
6. Resuspenda o pellet exossomo contendo em salina tamponada fosfato (PBS) e encher o tubo inteiro ultra-fino com PBS. Execute ultracentrifugação desta suspensão a 100.000 x g para 120 min a 4 ° C para eliminar as proteínas contaminantes.
7. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o exossomo em 100 µ l PBS. Loja a-80 ° C para uso futuro.
8. Para análise de microscopia eletrônica, coloque 3 µ l de suspensão de exosomal sobre uma grade de cobre revestido formvar microscópio de 200 malha por 5 min à temperatura ambiente. Continue com acetato de uranilo padrão manchando²³. Examine a grade semi seca por microscopia eletrônica de transmissão.

2. Intramiocárdica exossomo entrega

Nota: Usamos seis ratos em cada grupo.

1. ANESTHETIZE camundongos DBA/2J-DMD^MDX (> 10 meses de idade, do sexo masculino; peso corporal (PC) > 18 g) com injeção intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg de ketamina combinada com 10 mg/kg de xilazina BW BW e confirme a profundidade da anestesia com pitada de dedo do pé.
2. Corrigi cada rato em posição supina sobre uma plataforma cirúrgica usando fita para fixar cada membro e coloque uma sutura 3-0 horizontalmente abaixo os dentes superiores para prender o maxilar superior no lugar.
3. Aplica o creme depilatório para o lado esquerdo do peito do rato para remover o pelo da pele.
4. Realizar intubação endotraqueal através da cavidade oral, usando um cateter 24G e ventilar o mouse com o ar ambiente a uma taxa de 195 respirações por minuto usando um ventilador de roedor (ver a Tabela de materiais).
5. Desinfecte a pele com álcool de 75% e 10% de iodopovidona.
6. Fazer uma 10\u201215 mm oblíqua incisão da borda esquerda do esterno para a axila esquerda, cortar o peitoral maior e peitoral menor por uma tesoura e, em seguida, fazer uma toracotomia esquerda através do quarto espaço intercostal. Insira cuidadosamente as bandas afastador para espalhar a cavidade torácica para uma largura de 10 mm. Tome cuidado para não danificar o pulmão esquerdo.
7. Use duas pinças reta para remover o pericárdio, separá-los e colocá-los para trás as pontas retrator para expor o coração. Injetar MPC-Exo (50 μg em 30 µ l de PBS) ou 30 µ l PBS (como um controle) intramyocardially em parede anterior do ventrículo esquerdo, usando uma agulha de insulina 31 G em um site.
8. Use suturas de nylon 6-0 para fechar a cavidade torácica, os músculos peitoral e pele em sequência.
9. Recupere os ratos. Uma vez que a respiração espontânea, rítmica está presente, remova os ratos do ventilador e os tubos. Observar e registrar a condição de ratos após a cirurgia.

3. ecocardiografia

Nota: Um único observador cegado aos grupos experimentais executa ecocardiografia e análise de dados.

1. Dois dias após o transplante de PBS/exossomo, anestesia os ratos com isoflurano 1\u20122%.
2. Consertar um mouse em posição supina, usando a fita e aplique o gel acústico pré-aquecido na área no lado esquerdo.
3. Avalie a função ventricular esquerda pela ecocardiografia como descrito anteriormente,^16,24.
   1. Obter o esternal eixo longo de ventrículo esquerdo (LV) em duas dimensões (modo B) e em seguida girar a sonda de ultra-som 90º para obter uma visão de curto-eixo de LV ao nível do músculo papilar.
   2. Gravar imagens ecocardiográficas de modo-M e medida esquerda ventricular diastólica final diâmetro (LVEDD), volume final-sistólica ventricular esquerda (LVESD), volume final diastólico ventricular esquerdo (LVEDV) e volume final-sistólica ventricular esquerda (LVESV).
      Nota: Encurtamento fracionário (% de FS) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 e a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.

4. imuno-histoquímica

1. Dois dias após o transplante de PBS/exossomo, anestesiar os ratos (consulte a etapa 2.1) e abrir o esterno para expor a cavidade torácica. Dissecar a veia cava inferior e perfundir o coração com o ápice do ventrículo esquerdo com 3 mL de PBS, seguido de 3 mL de paraformaldeído 4% à temperatura ambiente, utilizando um cateter de borboleta com uma agulha de 25 G, ligada a uma seringa de 5 mL.
2. Incorporar corações fixas em parafina e cortados em seções de espessura 5 μm.
3. Deparaffinize slides em xilol e hidratar-se em soluções de etanol na seguinte ordem: 100% xileno (3 min), 100% de xileno (3 min), 100% de etanol (1 min), 100% de etanol (1 min), 95% de etanol (1 min), 80% de etanol (1 min), H₂O (1 min).
4. Corrigi cortes histologicos com paraformaldeído 4% para 8 min à temperatura ambiente.
5. Mergulhe os slides em citrato de sódio (0,01 M, pH 6.0) e executar a recuperação do antígeno, usando um recuperador de antígeno.
6. Permeabilize seções por 1h à temperatura ambiente com 1% polietileno glicol éter de tert-octilfenil em PBS.
7. Bloquear secções com 5% de soro de cabra em PBS por 1h à temperatura ambiente.
8. Incubar as seções com diluídos anticorpo primário (anticorpo antidistrofina) em PBS (1: 100) durante a noite a 4 ° C e, em seguida, lave tres vezes com PBS por 5 min.
9. Incube seções com diluídos anticorpo secundário (Alexa Fluor 488 Conjugado IgG de antibode coelho) em PBS (1: 400) por 45 min à temperatura ambiente.
10. Controle da autofluorescência usando uma têmpera de autofluorescência kit (veja a Tabela de materiais).
11. Meio de montagem de uso contendo DAPI (consulte a Tabela de materiais) para montar as lâminas.
12. Observe os slides sob um microscópio confocal.

Resultados

Um fluxograma para isolamento e purificação de exosomes de C2C12 células é mostrado na Figura 1A. Para confirmar a presença de exosomes, foram realizadas análises de microscopia eletrônica de transmissão. Imagem de microscopia eletrônica de transmissão (Figura 1B) mostra a morfologia das vesículas de exosomes de C2C12 derivado forma brilhante e redonda. Análise ocidental do borrão confirmou a presença de marcadores...

Discussão

O método de isolar exosomes puro é essencial para estudar a função de exosomes. Uma das técnicas comuns de isolamento do exossomo é Polietilenoglicóis (PEGs) mediada por precipitação^17,18,25. Exosomes pode ser precipitado em PEGs e peletizado por centrifugação de baixa velocidade. PEG-mediada purificação é muito conveniente e de baixo custo, não necessita de nenhum equipamento avançado, mas há preocupação com ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Filter	Fisherbrand	09-720-004
15 cm Cell Culture Dish	Thermo Fisher Scientific	157150
24 G catheter	TERUMO	SR-OX2419CA
31 G insulin needle	BD	328291
4% paraformaldehyde	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6-0 suture	Pro Advantage by NDC	P420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Antibiotic Antimycotic Solution	Corning	30-004-CI
Anti-Dystrophin antibody	Abcam	ab15277
Antigen retriever	Aptum Biologics	R2100-US	Antigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 cell line	ATCC	CRL-1772
Centrifuge	Unico	C8606
Change-A-Tip High Temp Cauteries	Bovie Medical Corporation	HIT
Confocal microscopy	Zeiss	Zeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx mice	The Jackson Laboratory	013141
DMEM	Corning	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
Goat serum	MP Biomedicals, LLC	191356
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Ketamine	Henry Schein	056344
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Mouse Retractor Set	Kent Scientific	SURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fisher Scientific	BP151-100
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	55-7066
SW-28 Ti rotor	Beckman	342207
The Vevo 2100 Imaging Platform	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100	Ultrasound System
Ultracentrifuge	Beckman	365672
Ultra-Clear Tubes	Beckman	344058
Xylazine (XylaMed)	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006