JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, geçici exosomes normal myogenic atası hücrelerden türetilmiş dikim tarafından Duchenne kas distrofisi farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için bir protokol mevcut.

Özet

Duchene müsküler distrofisi (DMD) fonksiyonel dystrophin protein eksikliğinden kaynaklanan bir X'e bağlı resesif genetik bir hastalıktır. Hastalık tedavi edilemez ve hastalık ilerledikçe hasta dilate kardiyomiyopati, aritmi ve konjestif kalp yetmezliği belirtileri gelişir. DMDMDX mutant fare dystrophin ifade edemediği ve DMD fare modeli olarak yaygın olarak kullanılır. Bizim son çalışmada, biz o intramyocardial enjeksiyon geniş türü (WT) gözlenen-geri geçici Miyokardiyum DMDMDX mutant farelerin dystrophin ifade myogenic progenitör hücre kaynaklı exosomes (MPC-Exo) hangi ilişkili ima kardiyak fonksiyon geçici bir iyileşme ile WT-MPC-Exo DMD kardiyak semptomlarını kontrol etmek için bir seçenek sağlar. MPC-Exo arıtma ve DMDMDX mutant farelerin kalpleri içine nakli tekniği bu makalede.

Giriş

Duchenne kas distrofisi (DMD) bir mutasyon DMD gen ve fonksiyonel dystrophin1kaybı nedeniyle bir X'e bağlı resesif, progressive nöromüsküler hastalıktır. Dystrophin öncelikle kas iskelet ve Miyokardiyum ifade edilir ve daha az düz kas, endokrin bezlerin ve nöronlar2,3' te ifade edilir. DMD 3.500-5000 yeni doğan çocuklar dünya çapında4,5başına bir bir insidansı ile Muskuler Distrofi en yaygın türüdür. Bireyler genellikle ilerleyici kas nekrozu, erken ergenlik ve ölüm nedeniyle kalp yetmezliği ve solunum yetmezliği6hayatlarının ikinci-üçüncü yıllarda tarafından bağımsız yürüme kaybı gelişir.

Dilate kardiyomiyopati, aritmi ve konjestif kalp yetmezliği DMD7,8ortak kardiyovasküler tutulum vardır. Hastalık tedavi edilemez, destekleyici tedavi semptomları veya kalp yetmezliği ilerlemesini geciktirmek, ama kalp fonksiyonu9,10artırmak çok zordur.

DMD hastaları, kas distrofisi X'e benzer (MDX) fare eksik dystrophin protein ve mevcut kardiyomiyopati11belirtileri ve bu nedenle ilişkili DMD kardiyomiyopati araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Dystrophin etkilenen kaslarda geri yükleyebilmek için Allojeneik Kök hücre tedavisi DMD12,13,14için etkili bir tedavi olduğu ispatlanmıştır. Exosomes, 30-150 nm membran veziküller çeşitli hücre tiplerinin tarafından salgılanan mesajcı RNA (mRNA) ve kodlamayan RNA'ların15,16,17 gibi genetik malzeme taşıma yoluyla hücre hücre iletişim önemli bir rol oynamaktadır ,18,19,20,21.

Bizim önceki çalışmalar myogenic progenitör hücrelerin (MPC), C2C12 hücre kültürünü gibi türetilmiş exosomes dystrophin aktarabilirsiniz göstermiştir bu allojeneik teslimini gösteren mRNA doğrudan kalp enjeksiyon22sonra ana bilgisayar cardiomyocytes için MPC kaynaklı exosomes (MPC-Exo) geçici DMD gen ekspresyonu MDX farelerde geri yükleyebilirsiniz. Bu makale MPC-Exo arıtma ve nakli teknikleri üzerinde duruluyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvanlar onaylı protokolleri ve hayvan refahı düzenlemeleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Gürcistan tıp Koleji Augusta Üniversitesi'nde ele.

1. izolasyon ve MPC kaynaklı Exosomes arıtma

  1. Tohum 5 x 10 ile 20 mL tam Dulbecco'nın bir 15 cm hücre kültür yemek6 C2C12 hücrelerde % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin G ve 100 μg/mL streptomisin içeren kartal orta (DMEM) değiştiren. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.
  2. Ya tükenmiş orta FBS ultrasantrifüj 100.000 x g , sallanan bir kova rotor kullanarak 4 ° C'de 18 h için hazırlayın. Pelet atmak.
  3. Ne zaman monolayer hücrelerin % 80 izdiham kültür tabağına ulaşmak tam DMEM ya tükenmiş orta ile değiştirin.
  4. Hücre kültür çanak üç kez olmak üzere toplam 48 her h süpernatant toplamak için transfer pipet kullanın. 50 mL santrifüj tüpleri ve vasıl 150 x g kalan hücreleri kaldırmak 10 dk santrifüj süpernatant toplamak.
  5. Süpernatant hücre artıkları ortadan kaldırmak için bir 0,22 mikron filtre ile filtre. Ultracentrifuge Ultra net tüp hareketli kova rotor de 100.000 x g 120 dk 4 ° C'de exosomes çökelti kullanarak filtre uygulanmış orta.
  6. Ya içeren Pelet fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspend ve tüm Ultra net tüp PBS ile doldurun. 100.000 x g de bu süspansiyon ultrasantrifüj 120 dk 4 ° C'de bulaşıcı proteinlerin ortadan kaldırmak için gerçekleştirir.
  7. Süpernatant atın ve eksozom Pelet 100 µL PBS resuspend. -80 ° c ileride kullanmak üzere saklayın.
  8. Elektron mikroskobu analiz için 3 µL exosomal süspansiyon, oda sıcaklığında 5 min için 200 mesh formvar kaplı bakır elektron mikroskobu kılavuz yerleştirin. 23boyama standart uranyl asetat ile devam edin. Yarı kuru kılavuz transmisyon elektron mikroskobu ile inceleyin.

2. Intramyocardial ya teslim

Not: Her grupta altı fareler kullanılır.

  1. 100 mg/kg BW 10 mg/kg ile BW xylazine kombine ketamin mayi (IP) enjeksiyonlu DBA/2J-DMDMDX fareler (erkek; vücut ağırlığı (BW) > 18 g yaş > 10 ay) anestezi ve anestezi derinliği ayak çimdik tarafından onaylayın.
  2. Her fare cerrahi bir platformda sırtüstü pozisyonda her bacak güvenli ve üst çene tutmak için yatay olarak dişleri aşağıda 3-0 dikiş yerleştirmek için bant kullanarak düzeltebilirsiniz.
  3. Kürk deri kaldırmak için fare göğüs sol tarafına depilatory krem uygulayın.
  4. Endotrakeal entübasyon 24 G kateter kullanarak ağız boşluğu üzerinden gerçekleştirmek ve fare ile oda havası kemirgen solunum kullanarak 195 nefes/dk hızında havalandırmak ( Tablo reçetesigörmek).
  5. Cilt %75 alkol ve % 10 povidone iyot ile dezenfekte.
  6. Bir 10\u201215 mm oblik insizyon sol sternal kenarından sol koltuk altı için yapmak, büyük pektoralis pektoralis küçük makas tarafından kesip, sonra sol Torakotomi dördüncü interkostal uzayda olun. 10 mm genişliğine göğüs boşluğuna yayılmaya Retraktörü bantları yavaşça yerleştirin. Sol akciğer hasarı önlemek için dikkat ediniz.
  7. Kalp zarını kaldırmak için onları ayır ve kalp ortaya çıkarmak için Retraktörü ipuçları yer onları iki düz cımbız kullanın. MPC-Exo enjekte (30 µL PBS içinde 50 μg) veya 30 μL PBS (kontrol) olarak intramyocardially bir sitede 31 G insülin iğne kullanarak sol ventrikül anterior duvar içine.
  8. 6-0 naylon dikiş göğüs boşluğuna, pektoralis kas ve cilt sırayla kapatmak için kullanın.
  9. Fareler kurtarmak. Ritmik, spontan solunum mevcut olduğunda, fareler havalandırma ve tüpü çıkarın. Gözlemlemek ve fareler koşulu ameliyattan sonra kaydedin.

3. Ekokardiyografi

Not: Deneysel gruplarına kör bir tek gözlemci Ekokardiyografi ve veri analizi yapar.

  1. İki gün sonra PBS/eksozom nakli, anestezi 1\u20122% isoflurane ile fareler.
  2. Bant kullanarak sırtüstü pozisyonda bir fare düzeltmek ve sol göğüs bölgesinde Önceden ısıtılmış akustik jel uygulayın.
  3. Sol ventrikül fonksiyonları Ekokardiyografi tarafından yukarıda açıklanan16,24değerlendirmek.
    1. İki boyutlu (B modu) olarak sol ventrikül (LV) parasternal uzun ekseni görünümünü elde etmek ve sonra Papiller kas düzeyinde bir LV kısa eksen görünümü elde etmek için ultrason sonda 90 ° döndürün.
    2. Kayıt M-modu Ekokardiyografik olarak görüntüler ve ölçü sol ventrikül son diyastolik çap (LVEDD), sol ventrikül sistolik son ses (LVESD), sol ventrikül diyastolik son ses (LVEDV) ve sol ventrikül sistolik son ses (LVESV).
      Not: Kesirli kısalma (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 ve Sol Ventrikül Ejeksiyon Fraksiyonu (VEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.

4. immünhistokimya

  1. İki gün sonra PBS/eksozom nakli, fareler (bkz. Adım 2.1) anestezi ve göğüs kemiği göğüs boşluğuna ortaya çıkarmak için kesmek. İnferior vena kava teşrih ve sol ventrikül tepe 3 mL 5 mL şırınga bağlı 25 G iğne ile bir kelebek kateter kullanarak, oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde 3 mL ardından PBS ile kalbine sıvı.
  2. Sabit kalpler parafin embed ve 5 mikron kalınlığında bölümlere kesti.
  3. Ksilen içindeki slaytları deparaffinize ve aşağıdaki sırayla etanol çözümlerinde rehydrate: % 100 Ksilen (3 dk), % 100 Ksilen (3 dk), % 100 etanol (1 dk), % 100 etanol (1 dk), % 95 etanol (1 dk), % 80'i etanol (1 dk), H2O (1dk).
  4. 8 dakika oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde ile doku bölümleri düzeltmek.
  5. Sodyum sitrat (0.01 M, pH 6.0) içindeki slaytları bırakın ve antijen alma bir antijen retriever kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.
  6. Bölümleri olarak % 1 polietilen glikol tert-octylphenyl eter PBS içinde oda sıcaklığında 1 h için permeabilize.
  7. Oda sıcaklığında 1 h için PBS içinde % 5 keçi serum bölümlerle engelleyin.
  8. Bölümleri ile seyreltilmiş birincil antikoru (anti-dystrophin antikor) PBS (1: 100), gecede 4 ° C'de kuluçkaya sonra üç kez PBS ile 5 dakika yıkayın.
  9. Bölümleri (Alexa Fluor 488 keçi Anti-tavşan IgG Birleşik) seyreltilmiş ikincil antikor PBS (1: 400) içinde oda sıcaklığında 45 dk ile kuluçkaya.
  10. Denetim autofluorescence bir autofluorescence Şoklama Kiti ( Tablo reçetesigörmek) kullanma.
  11. Kullanım montaj orta DAPI içeren (slaytları bağlamaya Malzemeler tablobkz:).
  12. Slaytları confocal mikroskop altında gözlemlemek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İzole edip exosomes C2C12 hücrelerden arıtma için bir akış şeması şekil 1içindeAgösterilir. Exosomes varlığını doğrulamak için transmisyon elektron mikroskobu çözümleme yapılır. Transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü (şekil 1B) elde edilen C2C12 exosomes parlak ve yuvarlak şekil veziküller morfolojisi gösterir. Western blot analizi doğruladı eksozom işaretleri, CD63 ve TSG101 de dahil olmak ü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Saf exosomes izole yöntemi exosomes işlev eğitim için esastır. Bir ortak teknikleri eksozom yalıtım için polietilen aracılı glikoller (mandal) yağış17,18,25' tir. Exosomes olabilir mandal içinde çöktürülmüş ve düşük hızlı Santrifüjü tarafından pelleted. PEG aracılı arıtma çok uygun, düşük maliyetli, Gelişmiş ekipman gerek değil, ama orada exosomes saflığı hakkında endişe beri diğer lip...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Tüm yazarlar bildirir hiçbir çıkar çatışmaları zorundalar.

Teşekkürler

Tang kısmen Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenen: GRNT31430008, NIH AR070029, NIH HL086555, NIH HL134354.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm FilterFisherbrand09-720-004
15 cm Cell Culture DishThermo Fisher Scientific157150
24 G catheterTERUMOSR-OX2419CA
31 G insulin needleBD328291
4% paraformaldehyde AffymetrixAAJ19943K2
50 mL Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific339652
6-0 suturePro Advantage by NDCP420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-11008
Antibiotic Antimycotic SolutionCorning 30-004-CI
Anti-Dystrophin antibodyAbcamab15277
Antigen retriever Aptum BiologicsR2100-USAntigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit Vector LaboratoriesSP-8400
C2C12 cell lineATCCCRL-1772
CentrifugeUnicoC8606
Change-A-Tip High Temp CauteriesBovie Medical CorporationHIT
Confocal microscopyZeissZeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx miceThe Jackson Laboratory013141
DMEMCorning 10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning 35-011-CV
Goat serum MP Biomedicals, LLC191356
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
KetamineHenry Schein056344
Mounting Medium with DAPI Vector LaboratoriesH-1500
Mouse Retractor SetKent ScientificSURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl etherFisher ScientificBP151-100
Rodent ventilatorHarvard Apparatus55-7066
SW-28 Ti rotorBeckman342207
The Vevo 2100 Imaging PlatformFUJIFILM VisualSonicsVevo 2100Ultrasound System 
UltracentrifugeBeckman365672
Ultra-Clear TubesBeckman344058
Xylazine (XylaMed)Bimeda-MTC Animal Health Inc.1XYL003 8XYL006

Referanslar

  1. Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
  2. Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
  3. Rae, M. G., O'Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
  4. Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
  5. D'Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
  6. Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
  7. Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
  8. Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  9. Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
  10. Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
  11. Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
  12. Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
  13. Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
  14. Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
  15. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
  16. Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
  17. Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
  18. Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
  19. Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
  20. Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268(2016).
  21. Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
  22. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
  23. Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381(2012).
  24. Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
  25. Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
  26. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  27. Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
  28. Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
  29. Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
  30. Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 146yaDuchenne kas distrofisiMyogenic progenit r h cres ral ultrasantrif jya nakliEkokardiyografikalp fonksiyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır