Очистка и трансплантация миогенных прогениторных клеток производные Exosomes для улучшения сердечной функции мышечной дистрофические мышей Дюшенна

Резюме

Здесь мы представляем протокол временно улучшить функции сердца в мышах мышечная дистрофия Дюшенна, трансплантация exosomes, производные от нормальных миогенных прародитель клеток.

Аннотация

Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) является Х-сцепленный рецессивный генетическое заболевание вызвано отсутствием функциональной делеций белка. Болезнь нельзя вылечить, а как болезнь прогрессирует, пациент развивает симптомы Дилатационная кардиомиопатия, аритмии и застойной сердечной недостаточности. ДМД^MDX мутантных мышей не выражают делеций и широко используются как мыши модель DMD. В нашем недавнем исследовании, мы наблюдали что intramyocardial инъекции широкий типа (WT)-миогенных прогениторных клеток, полученных exosomes (MPC-Exo) временно восстановлен выражение делеций в миокарде DMD^MDX мутантных мышей, который был связан с временным улучшением функции сердца, предполагая, что WT-MPC-Exo может предоставить возможность для облегчения сердечных симптомов DMD. Эта статья описывает технику MPC-Exo очищения и трансплантации в сердцах DMD^MDX мутантных мышей.

Введение

Мышечной дистрофии Дюшенна (ДМД) является Х-хромосомой рецессивных, прогрессивный нервно-мышечные заболевания вызванные мутация в гене DMD и потере функциональных делеций¹. Делеций выражается главным образом в скелетных мышцах и миокарда и менее выражена в гладкие мышцы, железы внутренней секреции и нейроны^2,3. DMD-это наиболее распространенный тип мышечной дистрофии с заболеваемостью одному 3500 до 5000 новорожденных мальчиков во всем мире^4,5. Люди обычно развиваются прогрессивная мышечная некроза, потеря независимых мимо раннего подросткового возраста и смерть в второй-третьей декадах их жизни из-за сердечной и дыхательной недостаточности⁶.

Расширенная кардиомиопатия, аритмии и застойной сердечной недостаточности являются проявлением DMD^7,8общих сердечно-сосудистой системы. Болезнь нельзя вылечить, поддерживающее лечение может улучшить симптомы или задержать прогрессирование сердечной недостаточности, но это очень трудно улучшить сердце функции^9,10.

Похож на ДМД пациентов, Х-хромосомой мышечная дистрофия (MDX) мышах дефицит белка делеций и настоящем симптомы кардиомиопатия¹¹и поэтому широко используются в ДМД связанные кардиомиопатия исследований. Чтобы восстановить делеций в пораженных мышц, аллогенных стволовых клеток оказалось эффективным средством лечения для ДМД^12,,1314. Exosomes, 30-150 Нм мембрана везикулы выделяемый различных типов клеток, играют ключевую роль в области коммуникации к ячейке посредством генетического материала транспорта, таких как матричная РНК (мРНК) и некодирующих RNAs^{15,16,17 ,18,19,,2021}.

Наши предыдущие исследования показали, что exosomes, производные от миогенных прогениторных клеток (ПДК), например C2C12 клеточной линии, могут передавать делеций мРНК в принимающей кардиомиоцитов после прямого впрыска сердца²², указывающее что аллогенной доставки MPC-производные exosomes (MPC-Exo) может временно восстановить DMD экспрессии генов мышей многомерных выражений. Эта статья посвящена методам очистки и трансплантации MPC-Экзо.

протокол

Животные были обработаны согласно утвержденных протоколов и правил животных институциональный уход животных и использование Комитета медицинский колледж Грузии в университете Augusta.

1. изоляция и очищение MPC-производные Exosomes

1. Семена 5 x 10⁶ C2C12 клеток в клетки культуры блюдо 15 см с полным Дульбекко 20 мл изменение орла носитель (DMEM) содержит 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 ед/мл пенициллин G и 100 мкг/мл стрептомицина. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂.
2. Подготовки обедненного exosome среднего ultracentrifugation FBS в 100,000 x g для 18 ч при 4 ° C, с помощью поворотной ведро ротора. Выбросите гранулы.
3. Замените полный DMEM обедненного exosome среднего когда монослоя клеток достигают 80% слияния в культуре блюдо.
4. Используйте передачу пипетки для сбора супернатант от клеток культуры блюдо каждые 48 ч, в общей сложности три раза. Соберите супернатант в 50 мл пробирок и центрифуги на 150 x g за 10 минут, чтобы удалить оставшиеся ячейки.
5. Фильтр супернатант через фильтр 0,22 мкм для ликвидации ячейки мусор. Ультрацентрифуги отфильтрованных среднего в ультрачистый труб с использованием размахивая ротор ведро на 100,000 x g для 120 мин при температуре 4 ° C для exosomes.
6. Ресуспензируйте Пелле exosome содержащих в-фосфатный буфер (PBS) и заполнить весь ультрачистый трубки с PBS. Выполните ultracentrifugation Эта подвеска в 100,000 x g для 120 мин на 4 ° C для ликвидации загрязняясь протеины.
7. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы exosome в 100 мкл PBS. Хранить при температуре-80 ° C для использования в будущем.
8. Для анализа электронной микроскопии место 3 мкл суспензии exosomal на 200 formvar покрытием меди микроскопа сетки для 5 мин при комнатной температуре. Продолжите с стандартным уранила ацетат пятнать²³. Изучите сетке полусухое, просвечивающей электронной микроскопии.

2. Intramyocardial Exosome доставки

Примечание: Мы использовали шесть мышей в каждой группе.

1. Анестезировать DBA/2J-DMD^MDX мышей (самец; возраст > 10 месяцев вес тела (BW) > 18 g) с впрыском внутрибрюшинного (и.п.) 100 мг/кг жм кетамина в сочетании с 10 мг/кг жм Ксилазина и подтвердите глубины анестезии, мыс пинча.
2. Исправьте каждую мышь в лежачем положении на хирургические платформе с помощью ленты для обеспечения каждой конечности и место шва 3-0 горизонтально ниже верхних зубов для хранения верхней челюсти на месте.
3. Применить депиляционный крем к левой стороне мыши груди, чтобы удалить мех из кожи.
4. Выполнять эндотрахеальной интубации через полости с помощью катетера 24 G и проветрить мыши с комнатным воздухом в размере 195 вдохов/мин с помощью грызунов Вентилятор (см. Таблицу материалов).
5. Дезинфекция кожи с 75% алкоголя и 10% повидон йод.
6. Сделать 10\u201215 мм наклонный разрез от левого края грудины к левой подмышечной впадине, сократить большую грудную крупных и мелких большую грудную ножниц, а затем сделать левая торакотомия через четвертое межреберное пространство. Аккуратно вставьте втягивающего полос распространить грудной полости шириной 10 мм. Позаботьтесь, чтобы избежать повреждения левого легкого.
7. Используйте две прямые пинцетом удалить перикарда, вытащить их друг от друга, и место их за советы втягивающего подвергать сердце. Придать MPC-Exo (50 мкг в 30 мкл PBS) или 30 мкл PBS (как элемент управления) intramyocardially в передней стенки левого желудочка с помощью 31 G инсулин иглы на одном сайте.
8. Используйте швы нейлона 6-0, чтобы закрыть грудной полости, большую грудную мышц и кожи в последовательности.
9. Восстановите мышей. Когда присутствует художественной, спонтанное дыхание, удалите мышей от вентилятора и экстубаций. Наблюдать и записывать состояние мышей после операции.

3. эхокардиография

Примечание: Один наблюдатель, ослепил в экспериментальной группы выполняет эхокардиографии и анализ данных.

1. Через два дня после пересадки PBS/exosome, анестезировать мышей с 1\u20122% изофлюрановая.
2. Исправить мышь в лежачем положении, с помощью липкой ленты и применять разогретой акустическая гель на левой груди.
3. Оценить функции левого желудочка методом эхокардиографии, как описано в^16,24.
   1. Получить мнение парастернальной длинной оси левого желудочка (LV) в двух измерениях (режим B) и затем поверните ультразвуковой зонд 90° для получения представления LV короткой оси на уровне папиллярных мышц.
   2. Запись M-режим Эхокардиографические изображений и мера левого желудочка конечного диастолического диаметр (LVEDD), левого желудочка конец систолический объем (LVESD), левого желудочка конечного диастолического объема (LVEDV) и левого желудочка конец систолический объем (LVESV).
      Примечание: Дробные укорочение (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 и фракция выброса левого желудочка (зна %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.

4. иммуногистохимии

1. Через два дня после пересадки PBS/exosome, анестезировать мышей (см. шаг 2.1) и разрезали грудины подвергать грудной полости. Вскрыть нижней полой вены и perfuse сердце через верхушки левого желудочка с 3 мл PBS, следуют 3 мл параформальдегида 4% при комнатной температуре, с помощью катетер бабочка с 25 G иглой, придает шприц 5 мл.
2. Встраивать фиксированной сердца в парафин и разрезать на 5 мкм толщиной секций.
3. Deparaffinize слайды в ксилоле и увлажняет в растворы этанола в следующем порядке: 100% ксилола (3 мин), 100% ксилола (3 мин), 100% этанола (1 мин), 100% этанола (1 мин), 95% этиловом спирте (1 мин), 80% этанола (1 мин), H₂O (1 мин).
4. Исправьте разделов ткани с параформальдегида 4% за 8 минут при комнатной температуре.
5. Погружать слайды в цитрат натрия (0.01 М, pH 6.0) и выполнять антигена извлечения с помощью ретривер антигена.
6. Разрушения разделы за 1 ч при комнатной температуре с 1% полиэтиленгликоль трет octylphenyl эфира в PBS.
7. Заблокировать разделы с 5% козьего сыворотки в PBS на 1 ч при комнатной температуре.
8. Инкубировать секции с разбавленным основного антитела (антитела анти делеций) в PBS (1: 100) на ночь при 4 ° C, а затем промойте PBS три раза за 5 мин.
9. Инкубируйте секции с разбавленным вторичное антитело (Alexa Fluor 488 конъюгированных коза анти кролик IgG) в PBS (1: 400) 45 мин при комнатной температуре.
10. Управления аутофлюоресценция с помощью закалки аутофлюоресценция комплекта (см. Таблицу материалов).
11. Использование установки носитель, содержащий DAPI (см. Таблицу материалы), для монтирования слайды.
12. Наблюдать за слайды под конфокального микроскопа.

Результаты

Схема для изоляции и очистки exosomes из C2C12 клеток показан на рис. 1A. Чтобы подтвердить присутствие exosomes, мы провели анализ передачи электронной микроскопии. Передача электронной микроскопии изображения (рис. 1Б) показывает морфология ярки...

Обсуждение

Метод изоляции чисто exosomes имеет важное значение для изучения функции exosomes. Один из распространенных методов для exosome изоляции является полиэтиленгликолей (шпеньки) при посредничестве осадков^17,18,25. Exosomes может быть химически осажденный ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Filter	Fisherbrand	09-720-004
15 cm Cell Culture Dish	Thermo Fisher Scientific	157150
24 G catheter	TERUMO	SR-OX2419CA
31 G insulin needle	BD	328291
4% paraformaldehyde	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6-0 suture	Pro Advantage by NDC	P420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Antibiotic Antimycotic Solution	Corning	30-004-CI
Anti-Dystrophin antibody	Abcam	ab15277
Antigen retriever	Aptum Biologics	R2100-US	Antigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 cell line	ATCC	CRL-1772
Centrifuge	Unico	C8606
Change-A-Tip High Temp Cauteries	Bovie Medical Corporation	HIT
Confocal microscopy	Zeiss	Zeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx mice	The Jackson Laboratory	013141
DMEM	Corning	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
Goat serum	MP Biomedicals, LLC	191356
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Ketamine	Henry Schein	056344
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Mouse Retractor Set	Kent Scientific	SURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fisher Scientific	BP151-100
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	55-7066
SW-28 Ti rotor	Beckman	342207
The Vevo 2100 Imaging Platform	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100	Ultrasound System
Ultracentrifuge	Beckman	365672
Ultra-Clear Tubes	Beckman	344058
Xylazine (XylaMed)	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006