Purification et la Transplantation de cellules progéniteurs myogéniques dérivé Exosomes afin d’améliorer la fonction cardiaque chez les souris dystrophiques musculaires de Duchenne

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour améliorer transitoirement la fonction cardiaque chez les souris de dystrophie musculaire de Duchenne en transplantant des exosomes dérivée de cellules progénitrices myogéniques normal.

Résumé

Duchene de Duchenne (DMD) est une maladie génétique récessive liée à le X causée par un manque de protéine dystrophine fonctionnelle. La maladie ne peut pas être guérie, et que la maladie progresse, le patient développe des symptômes d’insuffisance cardiaque congestive, arythmie et une cardiomyopathie dilatée. Les souris mutantes DMD^MDX n’expriment pas la dystrophine et sont couramment utilisés comme un modèle murin de DMD. Dans notre étude récente, nous avons observé que l’injection intramyocardique de type large (WT)-exosomes de dérivés de cellules progéniteurs myogéniques (MPC-Exo) restauré transitoirement l’expression de la dystrophine dans le myocarde de souris mutantes DMD^MDX , qui a été associé avec une amélioration transitoire en suggérant que la fonction cardiaque WT-MPC-Exo peut fournir une option pour soulager les symptômes cardiaques de DMD. Cet article décrit la technique de purification MPC-Exo et la transplantation dans les cœurs des souris mutantes DMD^MDX .

Introduction

Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une lié à le X récessive, progressive maladie neuromusculaire due à une mutation dans le gène DMD et la perte de la dystrophine fonctionnelle¹. La dystrophine est exprimée principalement dans le myocarde et le muscle squelettique et est moins exprimée dans le muscle lisse, les glandes endocrines et les neurones^2,3. DMD est le type le plus commun de la dystrophie musculaire avec une fréquence d’un par 3 500 à 5 000 garçons nouveau-nés dans le monde entier^4,5. Individus développent généralement une nécrose musculaire progressive, perte de la marche indépendante de début de l’adolescence et la mort dans les décennies de deuxième et troisième de leur vie en raison de l’insuffisance cardiaque et insuffisance respiratoire⁶.

Cardiomyopathie dilatée, arythmies et insuffisance cardiaque congestive sont des manifestations cardiovasculaires courantes de DMD^7,8. La maladie ne peut pas être guérie, un traitement de soutien peut améliorer les symptômes ou retarder la progression de l’insuffisance cardiaque, mais il est très difficile d’améliorer le cœur fonction^9,10.

Similaires aux patients DMD, la dystrophie musculaire liée à le X (MDX) souris sont déficientes en protéine dystrophine et les symptômes présents de cardiomyopathie¹¹et sont donc largement utilisés dans la recherche de cardiomyopathie DMD associé. Afin de rétablir la dystrophine dans les muscles affectés, la thérapie de cellules souches allogéniques s’est avéré pour être un traitement efficace pour la DMD^12,13,14. Exosomes, vésicules de membrane de 30-150 nm sécrétées par divers types de cellules, jouent un rôle clé dans la communication de cellule-cellule par l’intermédiaire de transport de matériel génétique, telles que l’ARN messager (ARNm) et non-codantes RNAs^{15,16,17 ,18,19,20,21}.

Nos études antérieures ont montré qu’exosomes dérivé de progéniteurs myogéniques (MPC), tels que la lignée C2C12, peut transférer la dystrophine ARNm d’hôte cardiomyocytes après injection cardiaque directe²², indiquant que la livraison allogénique de Les exosomes dérivé de MPC (MPC-Exo) peut restaurer transitoirement l’expression des gènes chez les souris MDX DMD. Cet article se concentre sur les techniques de purification et de la transplantation MPC-Exo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Les animaux ont été traités conformément aux protocoles approuvés et règlements de bien-être des animaux du comité d’utilisation de la Medical College of Georgia, à Augusta université et animalier institutionnel.

1. isolement et Purification des Exosomes dérivé de MPC

1. Cellules⁶ C2C12 semences 5 x 10 dans une boîte de Petri de cellule de 15 cm avec de Dulbecco complet 20 mL aigle modifié (DMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂.
2. Préparer le milieu appauvri en exosome par ultracentrifugation de FBS à 100 000 x g pendant 18 heures à 4 ° C à l’aide d’un rotor oscillant de seau. Jeter le culot.
3. Remplacer le DMEM complet avec milieu appauvri en exosome lorsque monocouche cellules atteignent 80 % confluent dans la boîte de pétri.
4. Utiliser une pipette de transfert pour recueillir le surnageant de la boîte de Petri de cellule toutes les 48 h pour un total de trois fois. Recueillir le liquide surnageant dans les tubes à centrifuger 50 mL et centrifuger à 150 x g pendant 10 min enlever les cellules restantes.
5. Filtrer le liquide surnageant à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les débris cellulaires. Ultracentrifugeuse le milieu filtré dans des tubes ultra claires par le rotor de seau se balançant à 100 000 x g pendant 120 min à 4 ° C à précipiter les exosomes.
6. Resuspendre le culot contenant de l’exosome dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remplir le tube ultra clair ensemble avec du PBS. Effectuer ultracentrifugation de cette suspension à 100 000 x g pendant 120 min à 4 ° C pour éliminer les protéines contaminantes.
7. Jeter le surnageant et resuspendre le culot de l’exosome dans 100 µL de PBS. Stocker à-80 ° C pour une utilisation future.
8. Pour une analyse au microscope électronique, placez 3 µL de suspension exosomal sur une grille de formvar revêtus de cuivre au microscope électronique de 200 mailles pendant 5 min à température ambiante. Continuer avec l’acétate d’uranyle standard²³de coloration. Examiner la grille semi sèche par microscopie électronique à transmission.

2. Intramyocardique Exosome livraison

Remarque : Nous avons utilisé des six souris dans chaque groupe.

1. D’offrir une souris DBA/2J-DMD^MDX (mâle, âge > 10 mois ; poids corporel (PC) > 18 g) avec l’injection intrapéritonéale (i.p.) de 100 mg/kg de poids vif de la kétamine combinée à 10 mg/kg de poids vif de xylazine et confirmer la profondeur de l’anesthésie par pincement de l’orteil.
2. Fixer chaque souris en décubitus dorsal sur une plate-forme chirurgicale à l’aide de ruban adhésif pour fixer chaque branche et placer une suture de 3-0 horizontalement sous les dents du haut pour tenir la mâchoire supérieure en place.
3. Appliquer la crème dépilatoire sur le côté gauche de la poitrine de souris pour enlever la fourrure de la peau.
4. Effectuer une intubation endotrachéale via la cavité buccale à l’aide d’un cathéter de 24 G et Ventilez la souris avec l’air ambiant à un taux de 195 respirations/min à l’aide d’un ventilateur de rongeur (voir la Table des matières).
5. Désinfecter la peau avec l’alcool à 75 % et 10 % polyvidone iodée.
6. Faire une incision oblique de 10\u201215 mm entre le bord gauche du sternum à l’aisselle gauche, couper le pectoral et pectoralis minor de ciseaux, puis effectuez une thoracotomie gauche par le quatrième espace intercostal. Insérer délicatement les bandes de rétracteur pour répandre la cavité thoracique pour une largeur de 10 mm. Prenez soin de ne pas endommager le poumon gauche.
7. Utiliser deux pinces droites pour enlever le péricarde, les separer et placez-les derrière les conseils de rétracteur pour exposer le cœur. Injecter le MPC-Exo (50 μg dans 30 µL de PBS) ou 30 μL PBS (comme un contrôle) intramyocardially dans la paroi antérieure du ventricule gauche en utilisant une aiguille de l’insuline de 31 G à un site.
8. Utiliser des sutures de nylon 6-0 pour fermer la cavité thoracique, muscles pectoraux et la peau en séquence.
9. Récupérer la souris. Présence d’une respiration rythmique, spontanée, retirer les souris du ventilateur et extuber. Observer et enregistrer l’état de la souris après la chirurgie.

3. Echocardiographie

Remarque : Un seul observateur aveuglé aux groupes expérimentaux effectue une analyse échocardiographie et données.

1. Deux jours après la transplantation de PBS/exosome, anesthésier les souris à l’isoflurane 1\u20122%.
2. Fixer une souris en décubitus dorsal à l’aide de ruban adhésif, puis appliquez le gel acoustique préchauffé sur la poitrine gauche.
3. Évaluer la fonction ventriculaire gauche par échocardiographie comme précédemment décrit^16,24.
   1. Obtenir la vue parasternale grand axe du ventricule gauche (VG) en deux dimensions (mode B) et puis faire pivoter la sonde d’échographie 90° pour obtenir une vue d’axe court LV au niveau du muscle papillaire.
   2. Enregistrer des images échocardiographiques mode M et mesure gauche ventriculaire télédiastolique diamètre (LVEDD), volume télésystolique ventriculaire gauche (LVESD), volume télédiastolique ventriculaire gauche (préopératoire) et volume télésystolique ventriculaire gauche (LVESV).
      Remarque : Fractionnaire raccourcissement (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 et la fraction d’éjection ventriculaire gauche (FEVG %) = [(LVEDV − LVESV) / préopératoire] x 100.

4. immunohistochimie

1. Deux jours après la transplantation de PBS/exosome, offrir une souris (reportez-vous à l’étape 2.1) et couper le sternum ouvert pour exposer la cavité thoracique. Disséquer la veine cave inférieure et perfuse le coeur dans l’apex du ventricule gauche avec 3 mL de PBS, puis 3 mL de paraformaldéhyde à 4 % à la température ambiante, à l’aide d’un cathéter de papillon avec une aiguille 25 G attachée à une seringue de 5 mL.
2. Intégrer des coeurs fixe dans la paraffine et coupez-les en coupes épaisses de 5 μm.
3. Déparaffiner diapositives de xylène et réhydrater en solutions d’éthanol dans l’ordre suivant : 100 % de xylène (3 min), 100 % xylène (3 min), 100 % d’éthanol (1 min), 100 % d’éthanol (1 min), éthanol à 95 % (1 min), 80 % d’éthanol (1 min), H₂O (1 min).
4. Difficulté des sections de tissu avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 8 min à température ambiante.
5. Immerger les lames dans le citrate de sodium (0,01 M, pH 6,0) et d’effectuer la recherche d’antigène à l’aide d’un extracteur d’antigène.
6. Permeabilize sections pendant 1 h à température ambiante avec éther de tert-octylphényle de polyéthylèneglycol de 1 % dans du PBS.
7. Bloquer les sections avec 5 % de sérum de chèvre dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
8. Incuber les sections avec l’anticorps primaire dilué (anticorps anti-dystrophine) dans du PBS (1/100) durant la nuit à 4 ° C, puis laver trois fois avec du PBS pendant 5 min.
9. Incuber les sections avec un anticorps secondaire dilué (Alexa Fluor 488 conjugué chèvre anti-lapin IgG) dans du PBS (1 : 400) pendant 45 min à température ambiante.
10. Contrôle en autofluorescence utilisant une trempe d’autofluorescence kit (voir la Table des matières).
11. Milieu de montage utilisation contenant DAPI (voir la Table des matières) pour monter les diapositives.
12. Observer les diapositives sous un microscope confocal.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Un ordinogramme pour isoler et purifier les exosomes des cellules C2C12 est montré dans la Figure 1A. Pour confirmer la présence des exosomes, nous avons effectué analyse de microscopie électronique à transmission. Image de microscopie électronique à transmission (Figure 1B) montre la morphologie des vésicules forme rond et lumineux des exosomes C2C12 dérivé. Analyse par Western blot ont confirmé la présence de marqu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

La méthode consistant à isoler les exosomes pure est essentielle pour l’étude de la fonction des exosomes. Une des techniques communes pour l’isolement de l’exosome est polyéthylène glycols (PEG) médiée par précipitation^17,18,25. Exosomes peut être précipité dans les chevilles et granulés par centrifugation à basse vitesse. PEG-mediated purification est très pratique et peu coûteux, il n’a pas besoin des ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm Filter	Fisherbrand	09-720-004
15 cm Cell Culture Dish	Thermo Fisher Scientific	157150
24 G catheter	TERUMO	SR-OX2419CA
31 G insulin needle	BD	328291
4% paraformaldehyde	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6-0 suture	Pro Advantage by NDC	P420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Antibiotic Antimycotic Solution	Corning	30-004-CI
Anti-Dystrophin antibody	Abcam	ab15277
Antigen retriever	Aptum Biologics	R2100-US	Antigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 cell line	ATCC	CRL-1772
Centrifuge	Unico	C8606
Change-A-Tip High Temp Cauteries	Bovie Medical Corporation	HIT
Confocal microscopy	Zeiss	Zeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx mice	The Jackson Laboratory	013141
DMEM	Corning	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
Goat serum	MP Biomedicals, LLC	191356
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Ketamine	Henry Schein	056344
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Mouse Retractor Set	Kent Scientific	SURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fisher Scientific	BP151-100
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	55-7066
SW-28 Ti rotor	Beckman	342207
The Vevo 2100 Imaging Platform	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100	Ultrasound System
Ultracentrifuge	Beckman	365672
Ultra-Clear Tubes	Beckman	344058
Xylazine (XylaMed)	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006