Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Zusammenfassung

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Zusammenfassung

Die Genombearbeitung mit dem CRISPR-Cas-System hat die Fähigkeit, die Genome verschiedener Organismen präzise zu bearbeiten, erheblich erweitert. Im Kontext von Säugetierzellen stellt diese Technologie ein neuartiges Mittel dar, um genomweite genetische Screens für funktionelle Genomstudien durchzuführen. Bibliotheken von Guide RNAs (sgRNA), die auf alle offenen Leserahmen abzielen, ermöglichen die einfache Generierung von Tausenden von genetischen Störungen in einem einzigen Pool von Zellen, die auf bestimmte Phänotypen untersucht werden können, um Genfunktion und zelluläre Prozesse in einem unvoreingenommenund systematisch. CRISPR-Cas-Bildschirme bieten Forschern eine einfache, effiziente und kostengünstige Methode, um die genetischen Blaupausen für zelluläre Phänotypen aufzudecken. Darüber hinaus kann die Differentialanalyse von Bildschirmen, die in verschiedenen Zelllinien und aus verschiedenen Krebsarten durchgeführt werden, Gene identifizieren, die kontextuell in Tumorzellen wichtig sind, und potenzielle Ziele für spezifische Krebstherapien aufzeigen. Die Durchführung genomweiter Bildschirme in menschlichen Zellen kann entmutigend sein, da dies den Umgang mit zig Millionen Zellen beinhaltet und eine Analyse großer Datenmengen erfordert. Die Details dieser Bildschirme, wie z. B. die Charakterisierung von Zellenlinien, Überlegungen zur CRISPR-Bibliothek und das Verständnis der Einschränkungen und Fähigkeiten der CRISPR-Technologie während der Analyse, werden häufig übersehen. Hier ist ein detailliertes Protokoll für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-basierten Bildschirmen vorgesehen.

Einleitung

CRISPR-Cas, kurz für gruppierte, regelmäßig interspaceierte kurze palindromische Wiederholungen und CRISPR-assoziierte Nuklease, besteht aus einem einzigen Nukleaseprotein (z.B. Cas9) in Komplex mit einer synthetischen Guide RNA (sgRNA). Dieser Ribonukleoprotein-Komplex zielt auf das Cas9-Enzym ab, um doppelsträngige DNA-Brüche an einem bestimmten genomischen Ort¹zu induzieren. Doppelsträngige Brüche können durch homology directed repair (HDR) oder, häufiger, durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) repariert werden, ein fehleranfälliger Reparaturmechanismus, der zum Einfügen und/oder Löschen (INDELS) führt, das häufig die Genfunktion stört. ¹. Die Effizienz und Einfachheit von CRISPR ermöglicht ein bisher unerreichbares Niveau der genomischen Ausrichtung, das die bisherigen Genom-Editing-Technologien [d.h. Zinkfingernukleasen (ZNF) oder Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen ( weit übertrifft ( TALENS), die beide unter erhöhter Designkomplexität, geringerer Transfektionseffizienz und Einschränkungen bei der Multiplex-Genbearbeitung²] leiden.

Die Grundlagenforschung der CRISPR-Single-Guide-RNA-basierten Genombearbeitung hat es Wissenschaftlern ermöglicht, die Funktionen einzelner Gene und die Topologie genetischer Interaktionsnetzwerke effizient und kostengünstig zu hinterfragt. Die Fähigkeit, funktionelle genomweite Bildschirme durchzuführen, wurde durch den Einsatz des CRISPR-Cas-Systems erheblich verbessert, insbesondere im Vergleich zu früheren genetischen Störtechnologien wie RNA-Interferenz (RNAi) und Gentrap-Mutagenese. Insbesondere leidet RNAi unter hohen Off-Target-Effekten und unvollständigem Knockdown, was zu einer geringeren Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu CRISPR^3,4,5führt, während Gentrap-Methoden nur bei haploiden Zellen für Funktionsverlustbildschirme, die den Umfang von Zellmodellen einschränken, die abgefragt werden können⁶. Die Fähigkeit von CRISPR, einen vollständigen Gen-Knock-out zu erzeugen, bietet ein biologisch robusteres System zur Abhörung mutierter Phänotypen mit geringem Rauschen, minimalen Off-Target-Effekten und konsistenter Aktivität über Reagenzien⁵. CRISPR-Cas9 sgRNA-Bibliotheken, die auf das gesamte menschliche Genom abzielen, sind jetzt weit verbreitet und ermöglichen die gleichzeitige Generierung von Tausenden von Gen-Knock-outs in einem einzigen Experiment^3,7,8,9 .

Wir haben einzigartige CRISPR-Cas9 genomweite sgRNA lentivirale Bibliotheken entwickelt, die Toronto Knock-out (TKO) Bibliotheken (verfügbar über Addgene) genannt werden, die kompakt und sequenzoptimiert sind, um hochauflösende funktionelle Genomik-Bildschirme zu ermöglichen. Die neueste Bibliothek, TKOv3, zielt auf 18.000 menschliche Protein-kodierende Gene mit 71.090 Leitfäden, die für die Bearbeitungseffizienz mit empirischen Daten optimiert sind¹⁰. Darüber hinaus ist TKOv3 als Einkomponenten-Bibliothek (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) verfügbar, die Cas9 und sgRNAs auf einem einzigen Vektor ausdrückt, wodurch die Notwendigkeit entsprochen wird, stabile Cas9-expressions-Zellen zu generieren, was genomweite Knock-out in einer breiten Palette von Säugetierzelltypen. TKOv3 ist auch in einem Vektor ohne Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID-Nr. 125517) erhältlich und kann in Zellen verwendet werden, die Cas9¹¹ausdrücken.

Eine genomweite CRISPR-Cas9-bearbeitete Zellpopulation kann unterschiedlichen Wachstumsbedingungen ausgesetzt werden, wobei die Fülle von sgRNAs im Laufe der Zeit durch Sequenzierung der nächsten Generation quantifiziert wird, was eine Auslesung zur Beurteilung von Aussteigern oder Anreicherung von Zellen mit rückverfolgbaren genetischen Störungen. CRISPR-Knock-out-Bibliotheken können genutzt werden, um Gene zu identifizieren, die bei Störungen zelluläre Fitnessdefekte, eine moderate Arzneimittelempfindlichkeit (z. B. empfindliche oder resistente Gene) verursachen, die Proteinexpression regulieren (z. B. Reporter) oder für eine bestimmte Signalwegfunktion und Zellzustand^12,13,14. Zum Beispiel können Differential-Fitness-Bildschirme in einer Krebszelllinie sowohl Erschöpfung oder Reduktion von Onkogenen und Anreicherung oder eine Zunahme der Tumorsuppressoren Gene^3,14,15identifizieren. In ähnlicher Weise kann die Verwendung von Zwischendosen von therapeutischen Medikamenten sowohl Arzneimittelresistenz als auch Sensibilisierungsgene^16,17zeigen.

Hier ist ein detailliertes Screening-Protokoll für das genom-skala CRISPR-Cas9 Verlust-von-Funktions-Screening mit den Toronto Knock-out Bibliotheken (TKOv1 oder v3) in Säugetierzellen von der Bibliotheksgenerierung, Screening-Performance bis zur Datenanalyse. Obwohl dieses Protokoll für das Screening mit den Toronto Knock-out-Bibliotheken optimiert wurde, kann es angewendet werden und auf alle gepoolten CRISPR sgRNA-Bibliotheken skalierbar werden.

Protokoll

Die nachstehend beschriebenen Experimente sollten den Richtlinien des Amtes für Umweltgesundheit und -sicherheit des Instituts entsprechen.

1. Gepoolte CRISPR sgRNA lentivirale Bibliothek Plasmid-Amplifikation

1. Verdünnen Sie die vorgefertigte CRISPR sgRNA Plasmid-DNA-Bibliothek in TE auf 50 ng/l (z. B. TKOv3).
2. Elektroporate die Bibliothek mit elektrokompetenten Zellen. Richten Sie insgesamt vier Elektroporationsreaktionen ein, wie unten beschrieben.
   1. Fügen Sie 2 l von 50 ng/L TKO-Bibliothek zu 25 l aufgetauten elektrokompetenten Zellen zu vorgekühlten Küvetten (1,0 mm) auf Eis hinzu.
   2. Elektroporate unter optimalen Einstellungen, die vom Herstellerprotokoll vorgeschlagen werden. Innerhalb von 10 s des Pulses 975 L Des Recovery Medium (oder SOC Medium) zur Küvette hinzufügen.
   3. Übertragen Sie elektropoierte Zellen in ein Kulturrohr und fügen Sie 1 ml Erholungsmedium hinzu. Röhren in einem Schüttelinkubator bei 250 U/min für 1 h bei 37 °C inkubieren.
3. Richten Sie eine Verdünnungsplatte ein, um die Bibliothek zu titern und die Transformationseffizienz zu schätzen.
   1. Alle 8 ml der zurückgewonnenen Zellen bündeln und gut mischen. Übertragen Sie 10 l der gepoolten Zellen auf 990 l Erholungsmedium für eine 800-fache Verdünnung und mischen Sie gut.
   2. Platte 20 l der Verdünnung auf eine vorgewärmte 10 cm LB + Carbenicillin (100 g/l) Agarplatte. Dies führt zu einer 40.000-fachen Verdünnung der Transformationsmittel, die zur Berechnung der Transformationseffizienz verwendet wird.
   3. Platte 400 l der wiedergewonnenen Zellen auf jeder Platte über insgesamt 20 vorgewärmte 15 cm LB + Carbenicillin Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten für 14–16 h bei 30 °C.
      HINWEIS: Das Wachstum bei dieser niedrigeren Temperatur minimiert die Rekombination zwischen Long-Terminal-Wiederholungen (LTR)¹⁸.
   4. Um die Transformationseffizienz zu berechnen, zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf der 40.000-fachen Verdünnungsplatte (Schritt 1.3.2). Multiplizieren Sie die Anzahl der gezählten Kolonien mit 40.000, um die Gesamtzahl der Kolonien auf allen Platten zu erhalten. Fahren Sie fort, wenn die Gesamtzahl der Kolonien eine Bibliotheksabdeckung darstellt, die mindestens 200x Kolonien pro sgRNA entspricht (am besten ist 500-1000x).
      1. Beispielsweise beträgt die minimale Koloniezahl für die TKOv3-Bibliothek (71.090 sgRNA) 1,4 x 10⁷, was 200x Kolonien pro sgRNA entspricht. Wenn die Koloniedarstellung nicht ausreicht, erhöhen Sie die Anzahl der Elektroporationen in Schritt 1.2 basierend auf der Anzahl der Kolonien auf der Verdünnungsplatte, um die minimale Bibliotheksabdeckung zu erreichen.
4. Ernte der Kolonien wie unten beschrieben
   1. Zu jeder 15 cm Platte 7 ml LB + Carbenicillin (100 g/L) medium hinzufügen und dann die Kolonien mit einem Zellstreuer abkratzen. Mit einer 10 ml Pipette die abgekratzten Zellen in einen sterilen 1 L Konuskolben oder eine Flasche übertragen.
   2. Spülen Sie die Platte erneut mit 5 ml LB + Carbenicillin-Medium ab und übertragen Sie die Lösung auf die Flasche.
   3. Wiederholen Sie dies für alle Platten, um Zellen von 20 Platten in eine sterile Flasche zu bündeln.
5. Mischen Sie gesammelte Zellen mit einer Rührstange für 1 h bei Raumtemperatur (RT), um Zellklumpen aufzubrechen. Übertragen Sie Zellen auf vorgewogene Zentrifugenflaschen und Zentrifuge mit 7.000 x g auf Pelletbakterien und entsorgen Sie dann Medien.
6. Wiegen Sie das Nasszellpellet und subtrahieren Sie das Gewicht der Zentrifugenflasche, um das Endgewicht des nassen Pellets zu bestimmen. Reinigen Sie Plasmid-DNA mit einem Maxi- oder Mega-Plasmid-Reinigungskit, abhängig von der Menge an bakteriellem Pellet, das jede Säule verarbeiten kann.

2. Großangelegte CRISPR sgRNA Bibliothek Lentivirus-Produktion

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt des Protokolls werden in einer BSL2+-Anlage in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II, Typ A2, ausgeführt.

1. Berechnen Sie die Anzahl der 15 cm Platten, die für die Virusproduktion erforderlich sind, basierend auf der Schätzung, dass 18 ml Virus in der Regel von einer 15 cm Platte geerntet werden.
2. Bereiten Sie Zellen für die Transfektion vor, indem Sie HEK-293T-Verpackungszellen in kohlenstoffarmen Wachstumsmedien (DMEM + 10% FBS + optional: 0,1x Pen/Strep) bei 8 x 10⁶ Zellen pro 15 cm Platte in 20 ml Medien aussäen. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 °C, 5%_CO2. Stellen Sie sicher, dass die vergoldeten Zellen zu 70 % bis zu 80 % konfluent sind und sich im Moment der Transfektion gleichmäßig ausbreiten.
3. Am nächsten Tag drei Transfektionsplasmide mischung enzuden, wie in Tabelle 1 für 15 cm Platten beschrieben. Berechnen Sie die Menge an Plasmid, die für eine Transfektion benötigt wird, und erstellen Sie eine Mischung von Plasmiden für die Anzahl der Platten, plus eines, das transfiziert werden soll.
4. Bereiten Sie ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz für jede Transfektion vor, wie in Tabelle 2 beschrieben. Aliquot reduzierte Serummedien in einzelne 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre für die Anzahl der zu transfizierenden Platten. Transfektionsreagenz hinzufügen, sanft mischen und 5 min bei RT inkubieren.
5. Fügen Sie nach 5 min Inkubation die für eine Transfektion erforderliche DNA-Menge dem Transfektionsreagenz für ein 3:1-Verhältnis des Transfektionsreagenz-zu-g des DNA-Komplexes hinzu. Mischen Sie sanft und inkubieren für 30 min bei RT.
   HINWEIS: Nachfolgende Transfektionen können in Sätzen von fünf oder weniger hergestellt werden, mit 5 min Intervallen, um die Zeit zu optimieren und eine Überinkubation zu vermeiden.
6. Nach 30 min Inkubation jede Transfektionsmischung sorgfältig auf jede Teller der Verpackungszellen übertragen. Fügen Sie die gesamte Mischung mit einer 1 ml Pipettenspitze tropfenweise in einer kreisförmigen Zickzackbewegung hinzu, ohne die Zellmonoschicht zu stören. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C für 18 h bei 5%_CO2.
7. Herstellung viraler Erntemedien: 500 ml DMEM-Medium + 32 ml BSA-Bestand (20 g/100 ml, gelöst in DMEM, Filter sterilisiert mit 0,22 m Filter) + 5 ml 100x Stift/Strep.
8. Nach 18 h Medien entfernen (die ordnungsgemäße Handhabung von Lentivirus-Abfällen wie Inkubation in 1% Natriumhypochlorit für 30 min vor der Entsorgung verwenden). Ersetzen Sie vorsichtig mit 18 ml viralen Erntemedien auf jeder Platte. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C für 18 h bei 5%_CO2.
9. Nach 24 h, überprüfen Sie Verpackungszellen auf abnormale und verschmolzene Morphologie als Hinweis auf eine gute Virusproduktion. Dann ernten Sie das Lentivirus, indem Sie alle Überstand eimperan und in ein steriles konisches Zentrifugenrohr übertragen.
10. Drehen Sie das Virusenthaltende Mit300 x g 5 min und pellet die Verpackungszellen. Aliquot den Überstand in ein steriles Polypropylenrohr, ohne das Pellet zu stören.
11. Lagern Sie das Virus bei 4 °C für kurze Zeiträume (weniger als 1 Woche) oder sofort bei -80 °C für die Langzeitlagerung. Aliquot groß angelegte Viren bereiten sich auf Single-Use-Volumes für langfristige Speicherung vor, um Einfrieren/Auftauen zu vermeiden.

3. Zellliniencharakterisierung zum Screening

1. Wählen Sie die gewünschte Zelllinie aus.
   1. Messen und erfassen Sie die ungefähre Verdoppelungszeit der Zellen.
   2. Bestimmen Sie die optimale Zellbeschichtungsdichte für die Kultivierung von Zellen, die sich alle 3–4 Zellen verdoppeln, in einem Gewebekulturgefäß ihrer Wahl (z. B. 15 cm Gewebekulturplatten).
2. Bestimmen Sie die Puromycin-Konzentration, die in der gewünschten Zelllinie für die Auswahl von TKO-Bibliotheken verwendet werden soll, die puromycin-Resistenzmarker wie folgt enthalten:
   1. Samenzellen in einer 12-Well-Platte mit der Dichte, die erforderlich ist, um den Zusammenfluss nach 72 h zu erreichen, dann über Nacht inkubieren (37 °C, 5%_CO2).
   2. Wechseln Sie am nächsten Tag zu einem Medium, das einen Verdünnungsbereich von Puromycin-Konzentrationen von 0 g/ml bis 10 g/ml in Schritten von 0,5 g/ml enthält. Inkubieren Sie die Zellen für 48 h.
   3. Messen Sie nach 48 h die Zelllebensfähigkeit durch Zellzählung oder alamarBlue Färbung.
   4. Bestimmen Sie die niedrigste Konzentration, die 100% der Zellen in 48 h abtötet. Verwenden Sie diese Konzentration, um für CRISPR-Bibliothek transduzierte Zellpopulationen in den Schritten 4.6 und 5.2.6 auszuwählen.
      HINWEIS: Bei Zelllinien mit längeren Verdoppelungszeiten können längere Inkubationen mit Puromycin toleriert werden. Bestimmen Sie in diesen Situationen die Kill-Kurve für die Inkubationszeit, die für <3-Zellverdoppelungen erforderlich ist. Minimieren Sie die Zeit für die Auswahl, um das Aussetzen wesentlicher Gene vor Beginn des Screenings zu vermeiden.
3. Überprüfen Sie die Zellen auf Empfindlichkeit gegenüber Hexadimethrinbromid (bis zu 8 g/ml), indem Sie eine Dosis-Antwort-Kurve nach dem gleichen Verfahren durchführen, das zur Messung der Puromycin-Empfindlichkeit verwendet wird (Schritt 3.2). Wenn eine Toxizität mit <8 g/ml Hexadimethrinbromid beobachtet wird, nicht anwenden.

4. Funktionelle Titration der gepoolten CRISPR lentivirus Bibliothek zur Bestimmung von MOI

1. Thaw ein frisches Aliquot von gepoolten CRISPR sgRNA Bibliothek lentivirus (z.B. LCV2::TKOv3) und auf Eis zu halten.
2. Entwerfen Sie eine Reihe von Virusvolumina, um zwischen 0–2 ml (d. h. 0 ml, 0,25 ml, 0,5 ml, 1 ml und 2 ml) zu testen.
3. Ernte zielzellen und Samenzellen in 15 cm Platten mit der Dichte, die erforderlich ist, um den Zusammenfluss in 72 h zu erreichen.
4. Bereiten Sie für jedes zu prüfende Virusvolumen doppelte Platten vor. Fügen Sie Zellen, Virus, Hexadimethrinbromid (8 g/ml) und Medien zu einem Endvolumen von 20 ml hinzu. Platten gründlich mischen, Platten im Inkubator auflegen und 24 h (37 °C, 5%_CO2)brüten.
5. Nach 24 h virushaltige Medien entfernen und entsorgen (Biosicherheitsvorkehrungen für den Umgang mit Lentivirus-Abfällen verwenden). Optional, waschen Sie die Platte vorsichtig mit warmen PBS, um fremde Viren zu entfernen.
6. Ersetzen Sie für jede Viruserkrankung 20 ml Medien, die Puromycin enthalten, mit der Konzentration, die zum Abtöten von Zellen in Abschnitt 3 bestimmt wurde, auf eine Replizierungsplatte. Auf die andere Platte, fügen Sie 20 ml frische Medien ohne Puromycin. Inkubieren für 48 h (37 °C, 5% CO₂).
7. Nach 48 h überprüfen Sie, ob alle nicht infizierten Zellen (0 ml Viruszustand), die mit Puromycin behandelt werden, tot sind. Ernten Sie alle Platten einzeln und dispergieren Sie die Zellen durch wiederholtes sanftes Pipettieren.
8. Zählen Sie Zellen aus allen Platten und berechnen Sie den MOI für jedes Virusvolumen, indem Sie die Zellzahl mit der Puromycinauswahl mit der Zellzahl ohne Puromycin (d. h. +/- Puromycin) vergleichen.
9. Graph Ergebnisse, um das Virusvolumen zu bestimmen, das zu 30% –40% Zellüberleben mit Puromycin-Auswahl im Vergleich zu ohne Puromycin führt. Verwenden Sie dieses Virusvolumen, um einen MOI von 0,3–0,4 während des Bildschirms unter den gleichen Gewebekulturbedingungen zu erreichen.

5. Primäre Bildschirminfektion, Auswahl und Zellpassaging

1. Wählen Sie die CRISPR sgRNA-Bibliotheksabdeckung aus, die auf dem gesamten Bildschirm beibehalten werden soll (empfohlen mindestens 200-fach).
   1. Bestimmen Sie anhand der Abdeckung der Bibliothek die Anzahl der Zellen, die erforderlich sind, um diese Abdeckung pro sgRNA aufrechtzuerhalten, und die Anzahl der Zellen, die für eine Infektion bei MOI 0,3 erforderlich sind (Tabelle 3).
   2. Bestimmen Sie die Anzahl der Platten, die zum Einrichten der Infektion erforderlich sind (Tabelle 4).
2. Infizieren der Zellen mit CRISPR-Bibliothek
   1. Erntezellen und Samen der erforderlichen Zellzahl auf jeder 15 cm Platte.
   2. Hexadimethrinbromid (8 g/ml) zu allen Platten hinzufügen.
   3. Fügen Sie das Virus in der für MOI 0.3 erforderlichen Menge zum Screening und zu den Control 2-Platten hinzu. Fügen Sie für Control 1 keinen Virus hinzu, und ersetzen Sie dieses Volume durch Medien.
   4. Mischen Sie Platten gründlich durch Kippen. Legen Sie Platten in den Inkubator, um sicherzustellen, dass sie eben sind.
      HINWEIS: Batch-Infektionen können durch die Kombination einer Master-Mischung aus Virus, Medien und Hexadimethrinbromid zu Zellen in Suspension vor der Beschichtung durchgeführt werden.
   5. Entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie sie durch frische Medien, die Puromycin in der in Schritt 3.2.4 ermittelten Konzentration zum Screening enthalten, und kontrollieren Sie 1 Platten 24 h nach einer Virusinfektion. Fügen Sie frische Medien ohne Puromycin auf die Steuer 2 Platte. Inkubationszellen für 48 h (37 °C, 5% CO₂).
   6. 48 h nach Puromycin-Zugabe, stellen Sie sicher, dass alle nicht infizierten Zellen tot sind (Kontrolle 1), um die Puromycin-Aktivität zu bestätigen, und ernten Sie dann die infizierten Zellen.
3. Ernte infizierter Zellpopulation und Zellpassaging
   1. Die aus Puromycin ausgewählten Zellen aus allen Siebplatten in einem sterilen Behälter ernten. Sammeln Sie die Zellen von jeder Steuerplatte separat. Zerstreuen Sie Zellen durch sanfte sandende Pipettierung.
   2. Zählen Sie Zellen aus gepoolten Screening-Zellen, steuern Sie 1 und steuern Sie 2 separat, und berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro 1 ml.
   3. Berechnen Sie DIE MOI- und Faltabdeckung wie folgt:
      
      
   4. Sammeln Sie drei Replikationen von Zellpellets aus den gepoolten Zellen in der ausgewählten Bibliothek Abdeckung für die genomische DNA-Extraktion. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min. Mit PBS waschen. Beschriften Sie die Rohre und trocknen Sie die Zellpellets bei -80 °C (dies sind T0-Referenzproben).
   5. Teilen Sie den Pool infizierter Zellen in drei Replikationsgruppen auf (z. B. Replizieren von A, Replizieren von B, Replikation C), während die Bibliotheksabdeckung innerhalb jeder Replikation beibehalten wird. Samenzellen mit der gleichen Saatdichte, wie sie normalerweise bei der Erweiterung verwendet würden. Verwenden Sie die gleiche Anzahl von Zellen für jede Replikationsplatte und die gleiche Gesamtzahl von Zellen zwischen Replikationen.
   6. Fahren Sie mit den Zellen fort und ernten Sie drei Wiederholungen von Zellpellets aus jeder Replikation von gepoolten infizierten Zellen wie oben, alle 3 bis 8 Tage, je nach Zelllinie, für bis zu 15 bis 20 Zellverdoppelungen. Ernten Sie bei jedem Durchgang die Zellen von allen Platten in jeder Replikationsgruppe miteinander (d. h. alle Zellen aus Replizierten A-Platten werden neu gemischt, alle Zellen aus Replizierten B-Platten werden neu gemischt usw.).
   7. Beschriften Sie jedes Pellet mit einer Zeit (T) und replizieren Sie die Bezeichnung. Dies entspricht der Anzahl der Tage nach T0, in denen das Pellet gesammelt wird (z.B. T3_A, T3_B, T3_C usw.).
4. Für die negativen Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion Selektion sekmittelieren, lassen Sie Zellen für mindestens eine Passage nach T0 vor der Behandlung erholen. Teilen Sie bei T3 oder T6 die Zellen aus jeder Replikationsgruppe (A, B, C) in die Populationen zur medikamentösen Behandlung und Kontrolle auf, wobei die gleiche Sädichte verwendet wird, die in Schritt 5.3.5 verwendet wird.
   1. Bündeln Sie separat die Anzahl der Zellen, die für die Bibliotheksabdeckung für jede Replikation in der Drogenbehandlungsgruppe erforderlich sind. Fügen Sie das Medikament in Zwischenkonzentrationen (IC₂₀-IC₅₀). Samen sie die Zellen und inkubieren (37 °C, 5%_CO2) bis zum nächsten Durchgang.
   2. Poolieren Sie separat die Anzahl der Zellen, die für die Bibliotheksabdeckung für jede Replikation in der Fahrzeugsteuerungsgruppe erforderlich sind. Fügen Sie die Fahrzeugsteuerung mit dem gleichen Volumen wie das Medikament hinzu (<0.5% v/v). Säen Sie die Zellen und brüten (37 °C, 5%_CO2) bis zum nächsten Durchgang.
   3. Fahren Sie fort, die Zellen zu durchforsten und die Zellpellets für genomische DNA alle 3 Tage zu ernten, wie in Schritt 5.3.5 beschrieben, während Sie das Medikament oder Fahrzeug an jeder Passage erfrischen.
5. Für die positive Auswahl oder Arzneimittelresistenz Bildschirme, teilen Sie jede Replikationsgruppe nach der Anzahl der Zellen für die Bibliothek Abdeckung erforderlich. Fügen Sie IC₉₀ Medikamentenkonzentrationen zu jeder Replikation hinzu. Bei IC₉₀wird ein Großteil der Zellen getötet. Lassen Sie resistente Populationen wachsen und sammeln Sie Zellpellets (1–2 x 10⁷ Zellen) für die genomische DNA-Extraktion.

6. CRISPR Probenvorbereitung und -sequenzierung

1. Genomische DNA-Reinigung
   1. Inkubieren Sie die gefrorenen Zellpellets für 5–10 min bei RT zum Auftauen.
   2. 1,4 ml PBS zu einem 50 ml Zentrifugenrohr hinzufügen, das ein Zellpellet enthält. Wirbel für 20 s, um die Zellen wieder auszusetzen und für 1 min ruhen. Bei Bedarf Pipette 15x mit P1000, um die verbleibenden Zellklumpen aufzubrechen. Wenn Sie Zellen aus einem 15 ml oder 1,5 ml-Rohr übertragen, setzen Sie die Zellen mit 1 ml PBS wieder auf, übertragen Sie dann zellen in ein 50 ml-Rohr und spülen Sie das Originalrohr mit 400 l PBS ab.
   3. Fügen Sie den resuspendierten Zellen 5 ml Nuclei Lysis Solution hinzu. Mischen Sie die Probe mit einer 10 ml Pipette, indem Sie die Probe 5x nach oben und unten pfeifen.
   4. Fügen Sie dem Kernlysat 32 l RNase A (20 mg/ml; um eine Endkonzentration von 100 g/ml) zu erhalten, und mischen Sie die Probe, indem Sie das Rohr 5x invertieren. Inkubieren Sie die Mischung bei 37°C für 15 min und lassen Sie die Probe für 10 min bei RT abkühlen.
   5. 1,67 ml Protein precipitation Solution zum Lysat und Wirbel kräftig für 20 s hinzufügen. Kleine Proteinklumpen können nach dem Mischen sichtbar sein.
   6. Zentrifuge bei 4.500 x g für 10 min bei RT.
   7. Mit einer 10 ml Pipette den Überstand in ein 50 ml Zentrifugenrohr mit 5 ml Isopropanol übertragen. Mischen Sie die Lösung 10x durch Inversion, bis die DNA beobachtet wird.
      HINWEIS: DNA kann als weiße, fadenartige Stränge beobachtet werden, die eine sichtbare Masse bilden.
   8. Zentrifuge bei 4.500 x g für 5 min bei RT, um die DNA zu pellet.
   9. Entfernen Sie mit einer 10 ml Pipette vorsichtig den Überstand und vermeiden Sie das Ablösen des DNA-Pellets. Fügen Sie der DNA 5 ml 70% Ethanol bei RT hinzu. Drehen Sie das Rohr vorsichtig, um das DNA-Pellet und die Seiten des Zentrifugenrohrs zu waschen.
   10. Zentrifuge bei 4.500 x g für 5 min bei RT.
   11. Mit einer 10 ml Pipette, entfernen Sie vorsichtig die 70% Ethanol und vermeiden, das DNA-Pellet zu vertreiben. Lufttrockene genomische DNA für 10 min bei RT.
   12. Fügen Sie der Tube 400 l TE-Lösung hinzu und lassen Sie die DNA durch Inkubation bei 65 °C für 1 h auflösen. Mischen Sie die DNA, indem Sie die Röhre alle 15 min sanft streichen. Wenn sich die DNA nicht vollständig auflöst, brüten Sie das Rohr bei 65 °C für weitere 1 h, während Sie das Rohr alle 15 min sanft flicken, und lassen Sie es über Nacht bei 4 °C.
   13. Zentrifugieren Bei 4.500 x g für 1 min bei RT und übertragen Sie genomische DNA in ein 1,5 ml niedrig bindendes Rohr.
   14. Quantifizieren und messen Sie die Reinheit der genomischen DNA sowohl auf dem Spektralphotometer (für den Gesamtnukleinsäuregehalt) als auch auf dem Fluorometer (für doppelsträngigen DNA-Gehalt).
2. Optional, niederschlagse genomische DNA, wenn es Probleme mit nachgeschalteter PCR-Verstärkung der sgRNA wie folgt gibt.
   1. Übertragen Sie 400 l genomische DNA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
   2. Fügen Sie 18 l von 5 M NaCl (Endkonzentration von 0,2 m) und 900 l mit 95 % Ethanol hinzu.
   3. Invertieren Rohr 10x bis gründlich gemischt, dann Zentrifuge bei 16.000 x g für 10 min bei RT.
   4. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und vermeiden Sie das Ablösen des DNA-Pellets. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 500 l 70% Ethanol. Drehen Sie das Rohr vorsichtig, um das DNA-Pellet zu waschen.
   5. Zentrifuge bei 16.000 x g für 5 min bei RT.
   6. Entfernen Sie vorsichtig Überstand und vermeiden Sie das Lösen von DNA-Pellets. Lufttrockene genomische DNA für 10 min bei RT.
   7. Fügen Sie 300 L VON TE hinzu, um die DNA aufzulösen, wie in den Schritten 6.1.12 beschrieben.
   8. Quantifizieren und messen Sie die Reinheit der genomischen DNA, wie in Schritt 6.1.14 beschrieben.
3. Vorbereitung der CRISPR-Sequenzierungsbibliothek
   1. Einrichten von PCR 1, wie in Tabelle 5 beschrieben, mit insgesamt 100 g genomischer DNA. Fügen Sie 3,5 g genomische DNA pro 50-L-Reaktion hinzu und richten Sie identische 50-L-Reaktionen ein, um die gewünschte Abdeckung zu erreichen. In Tabelle 6 sind Beispiele für Primersequenzen zur Verstärkung von LCV2::TKOv3-Sequenzierungsbibliotheken aufgeführt. Tabelle 7 listet Beispiele für Primersequenzen zur Verstärkung von pLCKO2::TKOv3-Sequenzierungsbibliotheken auf.
   2. PCR 1-Reaktionen in einem Thermocycler mit dem in Tabelle 8beschriebenen Programm verstärken.
   3. Überprüfen Sie die PCR 1-Amplifikation, indem Sie 2 l des PCR-Produkts auf einem 1% Agarose-Gel ausführen. PCR 1 liefert ein Produkt von 600 bp.
   4. Bündeln Sie alle einzelnen 50-L-Reaktionen für jede genomische DNA-Probe und mischen Sie sie durch Wirbeln.
   5. Richten Sie für jede Probe eine PCR 2-Reaktion (50 l) ein, wie in Tabelle 9 beschrieben, wobei 5 l des gepoolten PCR 1-Produkts als Vorlage verwendet werden. Verwenden Sie eindeutige Indexprimerkombinationen für jedes einzelne Beispiel, um das Pooling von Sequenzierungsbibliotheksbeispielen zu ermöglichen.
   6. Verstärken Sie die PCR 2-Reaktion in einem Thermocycler mit dem in Tabelle 10beschriebenen Programm.
   7. Saubere Agarose-Gel-Ausrüstung zur Reinigung verstärkter Produkte mit 0,1 N HCl für 10 min vor dem Gießen eines Gels. Bereiten Sie ein 2% Agarose-Gel vor, das DNA-Färbung enthält, um PCR 2-verstärkte Produkte zu reinigen.
   8. Führen Sie das PCR 2-Produkt auf dem 2% Agarose-Gel bei niedriger Spannung (1,0–1,5 h Lauf) aus. PCR 2 liefert ein Produkt von 200 bp.
   9. Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf einem Blaulichttransilluminator. Verbrauchen Sie das 200 bp-Band und reinigen Sie die DNA aus der Agarose-Gelscheibe mit einem Gel-Extraktionskit. Quantifizieren und messen Sie die Reinheit der Sequenzierungsbibliothek sowohl auf dem Spektralphotometer als auch auf dem Fluorometer.
      HINWEIS: Eine typische gelgereinigte Sequenzierungsbibliothekskonzentration reicht von 5–10 ng/l und eine Gesamtausbeute von 150–300 ng.
4. Hochdurchsatz-Sequenzierung
   1. Sequenzieren Sie die CRISPR-Sequenzierungsbibliotheken auf Sequenzern der nächsten Generation.
   2. Sequenzreferenz T0-Samples mit einer höheren Lesetiefe von 400- bis 500-facher Bibliotheksabdeckung. Sequenzexperimentelle Zeitpunktproben für Aussetzermiten mit einer Mindestlesetiefe von 200-fach. Für starke positive Selektionsbildschirme reicht eine Mindestlesetiefe von 50-facher Abdeckung für die Identifizierung angereicherter sgRNAs aus.
      HINWEIS: Es ist wichtig, das T0-Beispiel zu sequenzieren, um die Bibliotheksdarstellung für einen bestimmten Bildschirm zu bestimmen und als Referenz für die Bestimmung von sgRNA-Faltenänderungen im Laufe der Zeit zu dienen.

7. Datenanalyse

1. Richten Sie die Sequenz mithilfe von Programmen wie Bowtie aus, um Sequenzlesevorgänge mit den folgenden Parametern der Referenzbibliothek zuzuordnen: -v2 (erlaubt zwei Nichtübereinstimmungen) und -m1 (Verwerfen von gelesenen Lesevorgängen, die mehr als einer Sequenz in der Bibliothek zugeordnet sind).
2. Normalisieren Sie die Anzahl der eindeutig zugeordneten Lesevorgänge für jede sgRNA für eine bestimmte Probe auf 10 Millionen Lesevorgänge pro Probe wie folgt:
   10⁷
3. Berechnen Sie die log2-Faltenänderung jeder sgRNA für jede Replikation zu jedem Zeitpunkt (Tn) im Vergleich zur T0-Probe (Tn/T0). Fügen Sie allen Lesezählern eine Pseudoanzahl von 0,5 Lesevorgängen hinzu, um Diskontinuitäten von Nullen zu verhindern. SgRNAs mit <30 Rohleseinlesungen in der T0-Stichprobe von der Falzänderungsberechnung und der nachgelagerten Analyse ausschließen.
4. Analysieren Sie Faltenänderungen mit dem Bayesschen Analyse-Analyse-System für Diegeneessentialität (BAGEL) , wobei die wesentlichen und nicht-essentiellen Trainingssätze verwendet werden, die zuvor¹⁹ für Gen-Essentialitäts-Screens definiert wurden ( Zusatztabelle S1) oder DrugZ für Drogenbildschirme²⁰.
5. Berechnen Sie die Genauigkeit und den Rückruf für die Bildschirmleistungsbewertung mithilfe von BF-Scores. Verwenden Sie den wesentlichen Satz aus Schritt 7.4 als wahre Positivliste für die precision_recall_curve-Funktion der Scikit-learn-Bibliothek für Python, zusammen mit der obigen BF-Score-Teilmenge. Alternativ können Sie diegleiche auch mit dem PRROC-Paket in R ausführen.
6. Berechnen Sie die mittlere Faltenänderung aller Führungslinien für jedes Gen. Generieren Sie Dichtediagramme für die wesentlichen und nicht-essentiellen Gene (siehe Schritt 7.4) in R oder gleichwertiger Software. Wenn x.ess in R ein Vektor ist, der die Logfold-Änderungswerte wesentlicher Gene und x.nonEss enthält, enthalten sie nicht-essentielle Gene, plot mit dem folgenden Befehl:
   plot( dichte( x.ess ), xlab="mean logFC",col="red",lwd=2 )
   lines( density( x.nonEss ), col="blue",lwd=2 )
   HINWEIS: Für Python-Versionsdetails und verwendete Pakete siehe scikit-learn v0.19.1: (veröffentlicht von Pedregosa et al.²¹).

Ergebnisse

Überblick über den CRISPR-Screening-Workflow im Genommaßstab

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den gepoolten CRISPR-Screening-Arbeitsablauf, beginnend mit der Infektion von Zielzellen mit CRISPR-Bibliotheklentivirus bei niedrigem MOI, um einzelne Integrationsereignisse und eine angemessene Bibliotheksdarstellung zu gewährleisten (in der Regel 200 bis 1000 -falte). Nach de...

Diskussion

Aufgrund seiner Einfachheit und hohen Geschmeidigkeit wurde die CRISPR-Technologie weithin als Werkzeug der Wahl für die präzise Genombearbeitung angenommen. Das gepoolte CRISPR-Screening bietet eine Methode, um Tausende von genetischen Störungen in einem einzigen Experiment zu hinterfragt. In gepoolten Bildschirmen dienen sgRNA-Bibliotheken als molekulare Barcodes, da jede Sequenz einzigartig ist und dem Zielgen zugeordnet ist. Durch die Isolierung der genomischen DNA aus der Zellpopulation können Gene, die den Phä...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl	Promega	V4221
50X TAE buffer	BioShop	TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution	BioShop	HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue	ThermoFisher Scientific	DAL1025
Blue-light transilluminator	ThermoFisher Scientific	G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade	Bioshop	ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium	Life Technologies	11995-065	Cel culture media
Electroporation cuvettes	BTX	45-0134
Electroporator	BTX	45-0651
Endura electrocompetent cells	Lucigen	90293
Fetal Bovine Serum	GIBCO	12483-020
HEK293T packaging cells	ATCC	CRL-3216	recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)	Sigma	H9268	Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder	New England Biolabs	N3233S
Nanodrop spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix	New England Biolabs	M0544L
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit	Qiagen	12963
pMD2.G (envelope plasmid)	Addgene	Plasmid #12259	lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid)	Addgene	Plasmid #12260	lentiviral system
Puromycin	Wisent	400-160-UG
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28704
Qubit dsDNA BR assay	ThermoFisher Scientific	Q32853
Qubit fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33226
RNAse A	Invitrogen	12091021
S.O.C recovery medium	Invitrogen	15544034
SYRB Safe DNA gel stain	ThermoFisher Scientific	S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included	Addgene	Addgene ID #90203	Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9	Addgene	Addgene ID #125517	Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose	ThermoFisher Scientific	16500500
Wizard genomic DNA purification kit	Promega	A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent	Roche	06 365 809 001	Lipid based transfection reagent