Visualisierung und Quantifizierung hochdimensionaler Zytometriedaten mit Cytofast und den Upstream Clustering Methods FlowSOM und Cytosplore

Zusammenfassung

Cytofast ist ein Visualisierungstool, das zum Analysieren der Ausgabe aus Clustering verwendet wird. Cytofast kann verwendet werden, um zwei Clustering-Methoden zu vergleichen: FlowSOM und Cytosplore. Cytofast kann schnell einen quantitativen und qualitativen Überblick über Massenzytometriedaten generieren und die Hauptunterschiede zwischen verschiedenen Clustering-Algorithmen hervorheben.

Zusammenfassung

Die Komplexität der durch Massenzytometrie erzeugten Daten hat neue Tools erforderlich, um analytische Ergebnisse schnell zu visualisieren. Clustering-Methoden wie Cytosplore oder FlowSOM werden für die Visualisierung und Identifizierung von Zellclustern verwendet. Für die Downstream-Analyse kann ein neu entwickeltes R-Paket, Cytofast, eine schnelle Visualisierung der Ergebnisse aus Clustering-Methoden generieren. Cytofast berücksichtigt die phänotypische Charakterisierung von Zellclustern, berechnet die Häufigkeit des Zellclusters und vergleicht dann quantitativ Gruppen. Dieses Protokoll erklärt die Anwendung von Cytofast auf die Verwendung von Massenzytometriedaten auf der Grundlage der Modulation des Immunsystems in der Tumormikroumgebung (d. h. dem natürlichen Killer [NK] Zellreaktion) bei Tumorherausforderung gefolgt von Immuntherapie (PD-L1-Blockade). Gezeigt wird die Nützlichkeit von Cytofast mit FlowSOM und Cytosplore. Cytofast erzeugt schnell visuelle Darstellungen von gruppenbezogenen Immunzellclustern und Korrelationen mit der Zusammensetzung des Immunsystems. Unterschiede werden in der Clusteringanalyse beobachtet, aber die Trennung zwischen Gruppen ist mit beiden Clusteringmethoden sichtbar. Cytofast zeigt visuell die durch die PD-L1-Behandlung induzierten Muster, die eine höhere Fülle aktivierter NK-Zell-Teilmengen enthalten und eine höhere Intensität von Aktivierungsmarkern (d. h. CD54 oder CD11c) ausdrücken.

Einleitung

Die Massenzytometrie (Zytometrie durch Flugzeit oder CyTOF) ermöglicht den Nachweis einer breiten Palette intrazellulärer oder extrazellulärer Biomarker in Millionen von Einzelzellen. Die hochdimensionale Natur von Massenzytometriedaten erfordert bestimmte Analysewerkzeuge, wie z. B. Zellclustering-Techniken wie SPADE¹, FlowMaps², FlowSOM³, Phenograph⁴, VorteX⁵und Gerüstkarten⁶. Darüber hinaus wurden verschiedene auf Derinmaßungsreduktionbasierende Techniken entwickelt (z.B. Hauptkomponentenanalyse [PCA]⁷, t-verteilte stochastische Nachbareinbettung [t-SNE]⁸, hierarchische stochastische Nachbareinbettung [HSNE]⁹, einheitliche Verteilerannäherung und Projektion [UMAP]¹⁰und Diffusionskarten¹¹), um die Geschwindigkeit, Interpretation und Visualisierung von hochdimensionalen Datensätzen zu verbessern.

Bei der nachgelagerten Analyse hochdimensionaler Strömungs- und zytometrischer Massendaten fehlen häufig automatische Prozesse zur Durchführung statistischer Tests zur Clusterhäufigkeit und Verbindungen zu klinischen Ergebnissen. Zuvor haben wir einen R-basierten Workflow namens Cytofast¹²entwickelt, der visuelle und quantitative nachgelagerte Analysen von Clustering-Techniken durch Cytosplore oder FlowSOMermöglicht.

Das hier beschriebene Protokoll klärt die Verwendung von Cytofast in R und zeigt, wie quantitative und qualitative Heatmaps und Graphen erzeugt werden können. Darüber hinaus erleichtert es die Bestimmung von Verbindungen zwischen beobachteten Immun-Phänotypen und klinischen Ergebnissen. Dieser Bericht beschreibt auch die Analyse eines bestimmten Massenzytometrie-Datasets mit zwei verschiedenen Clustering-Prozeduren: FlowSOM und Cytosplore. Durch die Verwendung von Cytofast mit beiden Clustering-Methoden wird entsprechend gezeigt, dass der Aktivierungsphänotyp von NK-Zellen durch die PD-L1-Immun-Checkpoint-Blockade beeinflusst wird.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Animal Experiments Committee von LUMC genehmigt und gemäß den Tierversuchsrichtlinien des LUMC in Übereinstimmung mit den Richtlinien niederländischer und europäischer Ausschüsse durchgeführt.

ANMERKUNG: Für den Versuchsaufbau wurden C57BL/6-Mäuse an der rechten Flanke mit dem murinen Dickdarmtumor MC38 in einer Konzentration von 0,3 x 10⁶ Zellen/200 l phosphatgepufferter Salin (PBS) subkutan geimpft. Nach 10 Tagen, als Tumore fühlbar waren, wurden die Mäuse mit PD-L1-blockierenden Antikörpern behandelt (Klon MIH-5, 200 g/Maus, intraperitoneale Injektion) oder wurden mock-behandelt. Die Tumoren wurden 3 Tage später nach der PD-L1-Injektion resektiert, ex vivo verarbeitet und mit CyTOF-Massenzytometrie mit 38 Markern¹³analysiert.

1. Ausrüstung und Software für die Datenanalyse

HINWEIS: Verwenden Sie einen Computer (Windows 7 oder neuer) und Prozessor I5 mit 2,4 GHz oder gleichwertig, installierter Arbeitsspeicher RAM 6 GB, und 10 GB freien Festplattenspeicher. Das R-Paket Cytofast verwendet vorhandene Funktionen: hauptsächlich flowCore, pheatmapund ggplot. Die Befehlszeilen, die in R ausgeführt werden sollen, sind im Protokoll enthalten. Die Ressource für R-Anweisungen finden Sie unter https://education.rstudio.com/.

1. Um das Cytofast-Paket zu installieren, starten Sie R (Version "3.6") und installieren Sie Bioconductor Version 3.9, indem Sie den folgenden Code eingeben:
   
   if (!requireNamespace("BiocManager", leise = TRUE))
   install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("cytofast")
2. Stellen Sie sicher, dass das Paket in die gewünschte Umgebung geladen wird, indem Sie Folgendes ausführen:
   
   Bibliothek(cytofast)

2. Erstellen von Clustern

ANMERKUNG: Um die beiden Clustering-Methoden Cytosplore und FlowSOM mit Cytofastzu präsentieren, werden die NK-Zellen (CD161⁺) in der Tumor-Mikroumgebung 3 Tage nach der PD-L1-Behandlung analysiert.

1. Clustering vonCytosplore
   1. Nach dem Herunterladen und Installieren von Cytosplore, gehostet bei Cytosplore.org>, laden Sie die .fcs-Dateien (Ergänzende Dateien 1.1–1.8 [Cytosplore-Eingabedateien]) hoch, indem Sie auf Datei | Öffnen Sie FCS-Dateien in Cytosplore. Fügen Sie ein eindeutiges Beispiel-Tag als Kanal hinzu, indem Sie auf Eindeutiges Beispiel-Tag als Kanal hinzufügen klicken, wenn Sie dazu aufgefordert werden, und wählen Sie einen Cofaktor für die hyperbolische Arcsinh-Transformation aus (Standardwert ist 5).
   2. Wählen Sie H-SNE ausführen, führen Sie eine HSNE-Ebene von 3 aus, und warten Sie, bis die Karte generiert wird.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann einige Zeit in Rechnung stellen, abhängig von der Anzahl der analysierten Zellen und dem gewählten HSNE-Niveau.
   3. Überprüfen Sie auf der ersten HSNE-Ebene die Zellen, die positiv für CD161 sind. Wählen Sie die CD161⁺ Zellen und klicken Sie mit der rechten Maustaste in die Auswahl zoomen. Wiederholen Sie auf der zweiten Ebene den Vorgang, um die dritte Ebene mit nur CD161⁺ Ereignissen zu erreichen.
   4. Nachdem die letzte tSNE-Karte generiert wurde, speichern Sie die von Cytosplore definierten Cluster, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die tSNE-Karte klicken, und wählen Sie Cluster speichernaus. Wählen Sie das Verzeichnis der Ausgabedateien aus, wie von Cytosplore aufgefordert, und notieren Sie sich diesen Speicherort, da dieses Verzeichnis dann verwendet wird, um die .fcs-Dateien in R zu laden.
      HINWEIS: Die Anzahl der Teilmengen kann manuell geändert werden, indem der Sigma-Wert geändert wird. Der Sigma-Wert wird standardmäßig auf 30 gesetzt; Die tatsächliche Anzahl der Teilmengen hängt jedoch von der Eingabe ab. Hier hat Cytosplore 10 verschiedene Teilmengen erkannt, wobei jede Datei eine Teilmenge darstellt.
   5. Verwenden Sie beim Umbenennen der Ausgabedateien einen einfachen Namen (nur Zeichen), was die Identifizierung und weitere Handhabung erleichtert. Speichern Sie die Ausgabedateien, indem Sie Speichernauswählen.
      HINWEIS: Nach dem Speichern wird ein Ordner von Cytosplore mit den .fcs-Dateien erstellt, wobei jede Datei den identifizierten Clustern in Cytosploreentspricht. Der nächste Schritt wird das Laden der Dateien in R mit Hilfe von Cytofastsein. Hier werden die generierten Ausgabedateien in Supplementary Files 2.1–2.10 (Cytosplore-Ausgabedateien) bereitgestellt.
   6. Laden Sie die von Cytosplore generierten Ausgabedateien mit der angegebenen Funktion: readCytosploreFCS in R.
      
      dirFCS <- "C:-Benutzer-Benutzername, Desktop-Tostudy"
      cfData <- readCytosploreFCS(dir = dirFCS, colNames = "description")
   7. Bereinigen Sie die Daten, indem Sie einige Parameter wie "Zeit" und "Hintergrund" entfernen. Überprüfen Sie die Position der Spalte im Zusammenhang mit ihren unnötigen Parametern, und entfernen Sie sie aus der Matrix.
      
      colnames(cfData@expr)
      cfData@expr <- cfData@expr[,-c(3,4,6,8:10,46:49,51:54)]
      
      HINWEIS: Die unnötigen Spalten können durch Lesen der Spaltennamen der generierten Matrix angezeigt werden. Durch erneutes Ausführen von colnames(cfData@expr) stellen Sie sicher, dass nur die gewünschten Parameter abgerufen werden.
   8. Ordnen Sie die Markierungen so neu an, dass Linienmarkierungen zuerst angezeigt werden, gefolgt von funktionalen Markierungen.
      
      cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20,
      29,40,5,30,33,11,34,14,19,
      32,28,6,7,4,12,13,17,16,15,
      21,22,24,25,26,27,38,39)]
      
      HINWEIS: Schritt 2.1.8 ist optional.
   9. Verknüpfen Sie die Metadatendatei mit den generierten Daten aus Cytosplore, indem Sie die Tabellenkalkulations-Metadatei mit klinischen Informationen hochladen (Ergänzende Datei 3).
      
      Bibliothek(readxl)
      meta <- read_excel("C:'Users''''''''''''''''''''''''''''''sample_id'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
      cfData@samples <- data.frame(meta)
      
      HINWEIS: Das Clustering, das von Cytosplore durchgeführt wird, ist nun abgeschlossen. Eine alternative Clustering-Option zu Cytosplore ist FlowSOM und wird in Abschnitt 2.2 beschrieben. Nachdem einer der beiden Clusteringschritte ausgeführt wurde, fahren Sie mit dem Visualisierungsschritt fort (Abschnitt 3).
2. Clustering vonFlowSOM
   1. Installieren Sie FlowSOM zuerst in R, indem Sie den folgenden Befehl ausführen:
      
      if (!requireNamespace("BiocManager", leise = TRUE))
      install.packages("BiocManager")
      BiocManager::install("FlowSOM")
      Bibliothek(FlowSOM)
   2. Installieren Sie das flowCore-Paket mit einer ähnlichen Methode, und laden Sie es in die Umgebung, indem Sie Folgendes ausführen:
      
      if (!requireNamespace("BiocManager", leise = TRUE))
      install.packages("BiocManager")
      BiocManager::install("flowCore")
      Bibliothek(FlowSOM)
   3. Laden Sie die Rohdaten in Supplementary Files 4.1–4.8 (FCS FlowSOM-Eingang), die zuvor auf CD161+-Ereignissen abgegrenzt wurden, in R mit der Read.flowSet-Funktion.
      
      fcs_raw <- read.flowSet(path="C:'Users''user'''Desktop'tocluster', pattern = ".fcs", transformation = FALSE, truncate_max_range = FALSE, seed=123)
   4. Wählen Sie die relevanten biologischen Marker (entfernen Sie "Hintergrund" oder "Zeit"), indem Sie die richtigen Spalten auswählen und die Daten in einer arcsinh5-Manier transformieren, wie im folgenden Code gezeigt (hier entfernen Sie die Spalten 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, die keinem biologischen Marker entsprechen). Wenden Sie einen Cofaktor von 5 an, wie zuvor mit Cytosploreangewendet, indem Sie cofactor=5 in der folgenden Funktion auswählen.
      
      fcs_raw <- fsApply(fcs_raw, function(x, cofactor=5)"
      colnames(x) <- fcs_raw[[1]]@parameters@data-desc
      expr <- exprs(x)
      expr <- asinh(expr[,-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,37,38,51)]/ Cofaktor)
      exprs(x) <- expr
      return(x))
   5. Clustern Sie die Daten mithilfe der FlowSOM-Funktion. Um FlowSOM und Cytosplorezu vergleichen, können Sie die Daten in zehn Teilmengen als die zuvor von Cytosploreausgegebene Ausgabe gruppieren.
      
      fsom <- FlowSOM(fcs_raw, transformFunction = FALSE, scale = FALSE,
      scaled.center = FALSE, scaled.scale = FALSE, silent = FALSE, colsToUse = c(1:37),
      nClus = 10, maxMeta = 10, Bedeutung = NULL, Samen = 123)
      
      HINWEIS: Dies kann vom Benutzer manuell geändert werden.
   6. Weisen Sie jede Zelle ihrer identifizierten Teilmenge und Beispiel-ID zu.
      
      subset_id <- as.factor(fsom-FlowSOM-Mapping[,1])
      Ebenen(subset_id) <- fsom-metaclustering
      Kopf(subset_id)
   7. Laden Sie die Metadatendatei in R (verfügbar in Der Ergänzungsdatei 5), die die Gruppenzuweisung enthält, und verknüpfen Sie sie mit den .fcs-Dateien.
      
      sampleid <- read_excel("C:'Users'''''''''''sample_id''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
      sampleid <- na.omit(sampleid)
      
      sampleid-sampleID <- as.factor(sampleid-sampleID)
      sampleid-group <- as.factor(sampleid-group)
      sampleid-CSPLR_ST <- as.factor(sampleid-CSPLR_ST)
      
      sampleid <- as.data.frame(sampleid)
      names(sampleid)[3] <- "sampleID"
      sampleID <- lapply(fsom-FlowSOM-metaData, function(x)-rep(x[1], each = length(x[1]:x[2]))
      attr(sampleID, 'names') <- NULL
      sampleID <- as.factor(unlist(sampleID))
      sampleid <- data.frame(sampleid)
      levels(sampleID) <- paste("ID", 1:dim(sampleid)[1], sep="_")
      
      df <- data.frame(subset_id, sampleID, fsom-FlowSOM-daten[, c(1:37)])
      <- data.frame(colpar=fcs_raw[[1]]@parameters@data-desc) umbenennen
      colnames(df) <- c("clusterID", "sampleID", umbenennen Sie die Datei "colpar[c(1:37)])
      df-clusterID <- as.factor(df-Cluster-ID)
      df-sampleID <- as.factor(df-sampleID)
   8. Erstellen Sie eine cfList basierend auf dem von FlowSOM erhaltenen Datenrahmen, indem Sie das folgende Skript ausführen:
      
      cfData <- cfList(Samples = sampleid,
      expr = df)
   9. Ordnen Sie die Marker so an, dass sie ähnlich wie die Ausgabe aus der Cytosplore-Analyse angezeigt werden.
      
      cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,34,36,37,10,23,24,31,22,
      38,15,8,3,27,9,11,28,35,26,
      14,33,17,20,21,18,25,29,13,
      30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)]
      
      HINWEIS: Das Clustering von FlowSOM ist nun abgeschlossen. Führen Sie als Nächstes die Visualisierung der Clusterausgabe durch.

3. Visualisierung: Nachbearbeitungsclustering-Analyse

HINWEIS: Dieser Schritt ist eine Methode, die beiden Clusteringmethoden gemeinsam ist. Daher kann es nach dem Clustering entweder mit FlowSOM oder Cytosploredurchgeführt werden.

1. Generieren Sie vor dem Erstellen der Heatmaps die Zähltabelle pro Beispiel mithilfe der Funktionszellenanzahl, wie im folgenden Code dargestellt. Da einige Cluster weniger Zellen enthalten als andere, skalieren Sie die Daten pro Cluster, indem Sie innerhalb der Funktionszellen "scale = TRUE" angeben, sodass die Streuung zwischen den Stichproben leicht sichtbar werden kann.
   
   cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = TRUE)
   
   HINWEIS: Die Daten können nun visualisiert werden.
2. Visualisieren Sie mit Heatmap.
   ANMERKUNG: Eine der Hauptfunktionen dieses Pakets ist cytoHeatmaps, das verwendet wird, um den Phänotyp der erstellten Cluster sowie deren Heterogenität in Bezug auf die Samples zu visualisieren.
   
   cytoHeatmaps (cfData, group="group", legend=TRUE)
3. Visualisierung mit Boxplots
   HINWEIS: Daten können quantitativ dargestellt werden, indem die Funktion cytoBoxplots aufgerufen wird. Die Ausgabe dieser Funktion stellt den Anteil jeder Stichprobe für jeden Cluster dar.
   1. Generieren Sie die Zellenanzahl wie in Schritt 3.1, aber skalieren Sie die Daten nicht, um die Häufigkeit jedes Clusters abrufe.
      
      cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = FALSE)
      cytoBoxplots(cfData, group = "group")
4. Visualisierung mit medianem Intensitätssignal histogramm
   HINWEIS: Die Daten können auch durch Darstellung des Histogramms des Medianintensitätssignals visualisiert werden.
   1. Visualisieren Sie die Ausdrucksintensität von drei Markern: CD45, CD11c und CD54.
   2. Überprüfen Sie die Namen der gewünschten Marker, indem Sie die folgende Zeile aufrufen. Notieren Sie sich die Markernamen und fügen Sie sie in die msiPlot-Funktion ein.
      
      Namen(cfData@expr)
      
      HINWEIS: Konzentrieren Sie sich hier auf CD45, CD11c und CD54. Überprüfen Sie die genaue Schreibweise der Marker und passen Sie bei Bedarf an:
      
      msiPlot(cfData, markers = c("89Y_CD45", "167Er_CD11c","164Dy_CD54"), nach Group='group')

Ergebnisse

Der Workflow Cytofast (Abbildung 1) soll einen quantitativen und qualitativen Überblick über die Daten geben, die ursprünglich von Analysesoftware (z.B. FlowSOM oder Cytosplore) gruppiert wurden. Cytofast führt mehrere mögliche Ausgänge aus, einschließlich der Heatmap aller in der Analyse identifizierten Cluster und basierend auf Markerausdruck(Abbildung 2 und Abbildung 3). Das Dendrogramm oben stellt die hierarchische Ähnlichkeit zwischen den identifizierten Clustern dar. Im oberen Bereich wird eine weitere Heatmap mit der relativen Menge der entsprechenden Teilmengen in jeder Stichprobe angezeigt. Das Dendrogramm auf der rechten Seite zeigt die Ähnlichkeit zwischen Denproben und basiert auf hierarchischen Clustern, die auf den euklidischen Abstände zwischen den Proben durchgeführt werden. Die kombinierten Heatmaps werden für FlowSOM gefolgt von Cytofast in Abbildung 2 und für Cytosplore gefolgt von Cytofast in Abbildung 3angezeigt. Cytofast kann auch verwendet werden, um die Daten quantitativ darzustellen und die Ergebnisse in Boxplots (mit der CytoBoxplots-Funktion) anzuzeigen, wie in Abbildung 4 und Abbildung 5dargestellt.

Ähnliche Cluster wurden zwischen den beiden verschiedenen Methoden gefunden (z. B. entspricht Cluster 8 von Cytosplore Cluster 10 von FlowSOM), und die Co-Expression einiger hemmender Marker wie PD-1 und LAG-3 waren in beiden Methoden noch sichtbar). Beide Clustering-Methoden erlaubten eine Diskriminierung zwischen PD-L1 und. PBS behandelte Mäuse. Im Gegensatz dazu können einige Unterschiede zwischen beiden Methoden hervorgehoben werden. FlowSOM identifiziert 2 Cluster (MHC-II⁺), während Cytosplore nur einen Cluster zeigt (MHC-II^+dim). Dies ist auf die anfängliche Gating-Strategie zurückzuführen, bei der NK-Zellen manuell auf CD161⁺ Zellen abgezäut und dann von FlowSOMweiterverarbeitet wurden. Cytosplore hat jedoch automatisch Zellen aus der CD45^+-Population auf der ersten HSNE-Ebene abgegrenzt, die dann in einer höheren hierarchischen Ebene gruppiert wurden. So definierte Cytosplore die NK-Zellteilmengen genauer als die manuelle Gating-Fokussierung auf CD161. Dennoch wurde die hierarchische Clusterbildung der Stichproben beibehalten, wie im Dendrogramm auf der rechten Seite gezeigt, was darauf hindeutet, dass die Segregation zwischen den beiden Gruppen (PD-L1 und PBS) nicht von der gewählten Clusteringmethode abhängig war.

Die Anzahl der Cluster kann manuell mit beiden Methoden definiert werden. Cytofast ermöglicht es dem Benutzer, die Heterogenität seiner Daten zu bewerten und einen Einblick in die Auswahl der Anzahl der Cluster zu geben, in die die Daten aufgeteilt werden sollen. Weitere Funktionen sind im Cytofast-Paket enthalten, z. B. die msiPlot-Funktion (Schritt 3.4.2), die das Mediansignal Intensity (MSI)-Diagramm jedes Markers pro Gruppe anzeigt(Abbildung 6 und Abbildung 7). Diese Funktion ermöglicht die Erkennung globaler Veränderungen, wie z. B. Erhöhungen der Expression von CD54 oder CD11c in NK-Zellen der PD-L1-behandelten Gruppe. Optionale Funktionen können in das Cytofast-Paket integriert werden, z. B. das Anzeigen von Daten in Balkendiagrammen und anderen Methoden der Datendarstellung. Letzteres erfordert die Zugabe von ggplot-Werkzeugen, die von R generiert werden können.

Abbildung 1: Workflow des Cytofast-Pakets. Die Daten wurden durch Massenzytometrie aus einem Tumor 3 Tage nach der Behandlung mit Immuntherapie erzeugt oder unbehandelt gelassen. Zwei verschiedene Clustering-Techniken wurden verglichen: Cytosplore und FlowSOM. Cytofast wurde verwendet, um Unterschiede zwischen den beiden Techniken zu visualisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Clusterübersicht und Cluster-Überfluss pro Gruppe, wie von Cytofast nach Cytosploreanalysiert. Heatmap aller NK-Zellcluster (CD161⁺ Automatisch von Cytosploredefinierte Zellen ), die 3 Tage nach der Immuntherapie identifiziert wurden (PD-L1). Die angezeigten Daten basieren auf Cytosplore-Clustering und werden aus den unbehandelten und PD-L1-behandelten Gruppen gepoolt. Ebenen der ArcSinh5-transformierten Ausdrucksmarkierung werden auf einer Regenbogenskala angezeigt. Auf der unteren Ebene wird die relative Häufigkeit jeder Stichprobe durch die Grün-zu-Lila-Skala dargestellt. Das Dendrogramm auf der rechten Seite stellt die Ähnlichkeit zwischen Samples auf basisgesetzter Frequenzen dar. Die Frequenzskala stellt die Streuung des Mittelwerts dar. Eine niedrige oder eine hohe Frequenz wird durch eine grüne bzw. violette Farbe dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Clusterübersicht und Cluster-Überfluss pro Gruppe, wie von Cytofast nach FlowSOManalysiert. Heatmap aller NK-Zellcluster (vorgeziert auf CD161⁺ Ereignisse), die 3 Tage nach der Immuntherapie identifiziert wurden (PD-L1). Die angezeigten Daten basieren auf FlowSOM-Clustering und werden aus den unbehandelten und PD-L1-behandelten Gruppen gepoolt. Ebenen der ArcSinh5-transformierten Ausdrucksmarkierung werden auf einer Regenbogenskala angezeigt. Auf der unteren Ebene wird die relative Häufigkeit jeder Stichprobe durch die Grün-zu-Lila-Skala dargestellt. Das Dendrogramm auf der rechten Seite stellt die Ähnlichkeit zwischen Samples auf basisgesetzter Frequenzen dar. Die Frequenzskala stellt die Streuung des Mittelwerts dar. Eine niedrige oder eine hohe Frequenz wird durch eine grüne bzw. violette Farbe dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Zytofast-Darstellung mit Boxplots der von Cytosploredefinierten Cluster . Die Häufigkeit jedes Clusters wird in einem Boxplot dargestellt, getrennt in die beiden Gruppen (PBS und PD-L1). Ein einzelner Punkt entspricht einer Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Zytofast-Darstellung mit Boxplots der von FlowSOMdefinierten Cluster . Die Häufigkeit jedes Clusters wird in einem Boxplot dargestellt, getrennt in die beiden Gruppen (PBS und PD-L1). Ein einzelner Punkt entspricht einer Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Verteilung von Signalintensitätsdiagrammen aus NK-Zellen, die automatisch von Cytosploreabgegrenzt werden. Die Verteilung der Signalintensitäten wird in einem Histogramm für drei spezifische Marker angezeigt: CD45, CD11c und CD54. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Verteilung von Signalintensitätsdiagrammen aus NK-Zellen, die automatisch von FlowSOMabgegrenzt werden. Die Verteilung der Signalintensitäten wird in einem Histogramm für drei spezifische Marker angezeigt: CD45, CD11c und CD54, getrennt nach den Gruppen PBS und PD-L1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Dateien 1.1–1.8. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Ergänzende Dateien 2.1–2.10. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Ergänzende Datei 3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Ergänzende Dateien 4.1–4.8. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Ergänzende Datei 5. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Diskussion

Cytofast ist ein schnelles Rechenwerkzeug, das eine schnelle und globale Untersuchung zytometrischer Daten ermöglicht, indem behandlungsspezifische Zellteilmengen hervorgehoben und quantifiziert werden. Das beschriebene Protokoll zielt darauf ab, Clustering-Analysen mit Cytosplore oder FlowSOMweiter zu verarbeiten. Andere Clustering-Analysetools eignen sich für Cytofast, dies erfordert jedoch die Verwendung von Cytofast, um jede Zelle einer Teilmenge zuzuweisen. Cytofastist jedoch keine Clusteringmethode und erfordert daher Clusteringprozeduren vor der Verwendung.

Die hier durchgeführte Analyse zeigte, dass bestimmte CD161⁺ NK-Zellteilmengen in der Tumormikroumgebung empfindlich auf eine PD-L1-Blockade reagierten. Dies wurde durch Veränderungen in ihrem Phänotyp und Ihrer Häufigkeit belegt, die sowohl mit Cytosplore als auch mit FlowSOM als Clustering-Methoden beobachtet wurden. Beide Methoden unterschieden den wichtigsten NK-Zellcluster (CD11b⁺ NKG2A⁺) mit leicht unterschiedlichen Frequenzen (15%–20% für Cytosplore, 30% –40% für FlowSOM). Die Unterschiede in der Häufigkeit und diese Annäherung wirkten sich nicht auf das globale Muster aus, da beide Dendrogramme, die in den rechten Farbfeldern von Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt waren, ähnliche Ergebnisse zeigten. Durch die Verwendung von Cytofastist es somit (unabhängig von der gewählten Clustering-Methode) möglich, PD-L1-behandelte und unbehandelte Mäuse auf der Grundlage von Analysen des NK-Zellcluster-Phänotyps und der Häufigkeit zu trennen.

Abhängig von den aufgezeichneten Parametern sind Änderungen am Protokoll erforderlich. Insbesondere müssen bestimmte Parameter wie Zeit und Hintergrund während der Clusteranalyse entfernt werden. Darüber hinaus ist es wichtig, dass jede Zelle einer Teilmenge zugewiesen wird. Die cfData-Funktion fügt einfach die unformatierten Zellenzahlen pro Cluster pro Sample in die cfList ein. In diesem Schritt kann die Cytoheatmap wie in Abschnitt 3 erläutert erstellt werden.

Cytofast wurde erfolgreich als Visualisierungs- und Quantifizierungstool zum Vergleich verschiedener Clustering-Methoden¹³eingesetzt. Dieses R-Paket ist auch mit erweiterten Funktionen kompatibel, z. B. dem globaltest¹⁴, der Zuordnungen zwischen Clustergruppen mithilfe klinischer Variablen testen kann. In Zukunft können das globaltest-Tool und andere Algorithmen mit Cytofast integriert werden, um eine detailliertere Visualisierung und Quantifizierung zu ermöglichen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Dell	NA	NA