Trägergestützte Ein-Topf-Probenvorbereitung für die gezielte Proteomik-Analyse kleiner Mengen menschlicher Zellen

Zusammenfassung

Eine proteinträgergestützte Eintopf-Probenvorbereitung in Verbindung mit der Flüssigchromatographie (LC) - Selected Reaction Monitoring (SRM) - wird als cLC-SRM bezeichnet und ist eine praktische Methode für die gezielte Multiplex-Proteomik-Analyse einer kleinen Anzahl von Zellen, einschließlich einzelner Zellen. Es profitiert von der Verwendung von überschüssigem exogenem Protein als Träger und hochspezifischem LC-SRM für eine gezielte Quantifizierung.

Zusammenfassung

Die Proteinanalyse einer kleinen Anzahl menschlicher Zellen wird in erster Linie durch gezielte Proteomik mit Antikörper-basierten Immunoassays erreicht, die inhärente Einschränkungen aufweisen (z. B. geringes Multiplex und Nichtverfügbarkeit von Antikörpern für neue Proteine). Die auf Massenspektrometrie (MS) basierende zielgerichtete Proteomik hat sich als Alternative herausgestellt, da sie antikörperfrei ist, ein hohes Multiplex aufweist und eine hohe Spezifität und Quantifizierungsgenauigkeit aufweist. Jüngste Fortschritte in der MS-Instrumentierung ermöglichen die MS-basierte zielgerichtete Proteomik für die Multiplex-Quantifizierung von Proteinen mit hoher Häufigkeit in einzelnen Zellen. Es gibt jedoch eine technische Herausforderung für die effektive Verarbeitung einzelner Zellen mit minimalem Probenverlust für die MS-Analyse. Um dieses Problem zu lösen, haben wir kürzlich eine praktische proteinträgergestützte Eintopf-Probenvorbereitung in Verbindung mit der Flüssigchromatographie (LC) entwickelt - ausgewähltes Reaktionsmonitoring (SRM), genannt cLC-SRM für die gezielte Proteomik-Analyse kleiner Mengen menschlicher Zellen. Diese Methode nutzt die Verwendung des kombinierten exogenen Proteins als Träger und die Eintopfverarbeitung mit geringem Volumen, um die Adsorptionsverluste an der Oberfläche stark zu reduzieren, sowie LC-SRM mit hoher Spezifität, um den erhöhten dynamischen Konzentrationsbereich aufgrund der Zugabe von exogenem Trägerprotein effektiv zu adressieren. Seine Nützlichkeit wurde durch die genaue Quantifizierung der meisten mäßig häufigen Proteine in einer kleinen Anzahl von Zellen (z. B. 10-100 Zellen) und von sehr häufigen Proteinen in einzelnen Zellen nachgewiesen. Die einfach zu implementierenden Funktionen und die Tatsache, dass keine speziellen Geräte erforderlich sind, machen diese Methode für die meisten Proteomik-Labore leicht zugänglich. In diesem Dokument haben wir ein detailliertes Protokoll für die cLC-SRM-Analyse einer kleinen Anzahl menschlicher Zellen bereitgestellt, einschließlich Zellsortierung, Zelllyse und -verdauung, LC-SRM-Analyse und Datenanalyse. Weitere Verbesserungen der Nachweisempfindlichkeit und des Probendurchsatzes sind für eine gezielte Einzelzell-Proteomik-Analyse erforderlich. Wir gehen davon aus, dass cLC-SRM in der biomedizinischen Forschung und Systembiologie breit eingesetzt wird, mit dem Potenzial, die Präzisionsmedizin zu erleichtern.

Einleitung

Jüngste technologische Fortschritte in der Genomik (Transkriptomik) ermöglichen eine umfassende und präzise Analyse des Genoms (Transkriptom) in einzelnen Zellen ^1,2,3. Die Einzelzell-Proteomik-Technologien hinken jedoch weit hinterher, sind aber genauso wichtig wie die Genomik (Transkriptomik) 4,5,6,7,8. Darüber hinaus kann die Proteinhäufigkeit nicht unbedingt aus der mRNA-Häufig....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

HINWEIS: Die Schritt-für-Schritt-Analyse des cLC-SRM ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbehandlung von PCR-Röhrchen

1. Geben Sie 100 μl nichtmenschliche (z. B. Shewanella oneidensis) Zelllysatverdaue in einer Menge von 0,2 μg/μl in PCR-Röhrchen. Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren, um die Oberfläche des PCR-Röhrchens zu beschichten.
2. Entfernen Sie die Zelllysatverdaue durch Pipettieren, spülen Sie die PCR-Röhrchen 3 Mal mit Wasser in HPLC-Qualität und trocknen Sie die PCR-Röhrchen dann in einem Abzug.
3. Bewahren Sie beschichtete PCR-Rö....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Kleine Mengen an MCF7-Zelllysaten (0,5-20 ng äquivalent zu 5-200 Zellen) wurden zunächst verwendet, um die Leistung von cLC-SRM durch gezielte Quantifizierung von Proteinen des EGFR/MAPK-Signalwegs zu bewerten, da sie im Vergleich zu kleinen Mengen von Zellen, die nach FACS sortiert wurden, einheitlicher sind und weniger variieren. Wie in Abbildung 2A gezeigt, zeigt XICs deutlich die Detektion von SRM-Übergängen für ATAD.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

cLC-SRM ist eine praktische zielgerichtete Proteomik-Methode, die eine genaue Multiplex-Proteinanalyse einer kleinen Anzahl von Zellen, einschließlich einzelner Zellen, ermöglicht. Diese Methode nutzt die Vorteile der proteinträgergestützten Eintopf-Probenvorbereitung, bei der alle Schritte, einschließlich der Zellentnahme, der mehrstufigen Zelllyse und des Zellverdaus sowie des Transfers der Peptidverdaue in eine Kapillar-LC-Säule für die MS-Analyse, in einem Topf (z. B. Einzelr?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL glass LC vial	Microsolv	9502S-WCV	Vessel to hold PCR tube for autosample injection
BSA	Sigma-Aldrich	P0834-10×1mL	Carrier protein for greatly reducing surface adsorption losses
DTT	Thermo Scientific	A39255	Reagent for reduction
Formic acid	Thermo Scientific	28905	Reagent for stopping enzyme reaction
IAA	Thermo Scientific	A39271	Reagent for alkylation
Peptide internal standards	New England peptide		Targeted quantification of EGFR/MAPK pathway proteins
RT-PCR tube	GeneMate Bioexpress	T-3035-1	0.2 mL PCR tube for one-pot sample preparation
Skyline software	University of Washington		Publicly available for SRM data analysis
Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UTR200	Sonication on ice for cell lysis
Speed Vac concentrator	Thermo Scientific		Reduction of the percentage of TFE for effective trypsin digestion
TFE	Sigma-Aldrich	18370-10×1mL	60% TFE for cell lysis
Thermocycler w/ heated lid	Peltier Thermal Cycler	PTC-200	Heating for protein denaturation
Trypsin Gold	Promega	V528A	Enzyme for protein digestion
Waters BEH C18 column	Waters		C18 column for peptide separation