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Zusammenfassung

Ein In-vitro-Modell der Gefäßnische des Knochenmarks wird erstellt, indem mesenchymale und endotheliale Zellen auf vorgegossene 3D-PEG-Hydrogele gesät werden. Die endothelialen Netzwerke, die EZM-Komponenten und die ALP-Aktivität der Nischen variieren je nach verwendetem Wachstumsfaktor. Die Plattform kann für fortgeschrittene Krebsmodelle verwendet werden.

Zusammenfassung

Der Knochen und das Knochenmark sind stark vaskularisierte und strukturell komplexe Organe und Orte für Krebs- und Metastasenbildung. In-vitro-Modelle , die knochen- und knochenmarkspezifische Funktionen, einschließlich der Vaskularisierung, rekapitulieren, die mit dem Wirkstoffscreening kompatibel sind, sind sehr wünschenswert. Solche Modelle können die Lücke zwischen einfachen, strukturell irrelevanten zweidimensionalen (2D) In-vitro-Modellen und den teureren, ethisch anspruchsvollen In-vivo-Modellen schließen. Dieser Artikel beschreibt einen kontrollierbaren dreidimensionalen (3D) Co-Kultur-Assay auf Basis von technisch hergestellten Poly(ethylenglykol) (PEG)-Matrizen zur Erzeugung vaskularisierter, osteogener Knochenmarknischen. Das PEG-Matrix-Design ermöglicht die Entwicklung von 3D-Zellkulturen durch einen einfachen Zellaussaatschritt, der keine Verkapselung erfordert, und ermöglicht so die Entwicklung komplexer Co-Kultursysteme. Darüber hinaus sind die Matrizen transparent und auf 96-Well-Speicherfolien mit Glasboden vorgegossen, wodurch das System für die Mikroskopie geeignet ist. Für den hier beschriebenen Assay werden zunächst humane mesenchymale Stromazellen (hBM-MSCs) aus dem Knochenmark kultiviert, bis sich ein ausreichend entwickeltes 3D-Zellnetzwerk gebildet hat. Anschließend werden GFP-exprimierende humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) hinzugefügt. Auf die Kulturentwicklung folgt die Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie. Das Vorhandensein des hBM-MSC-Netzwerks unterstützt die Bildung von gefäßähnlichen Strukturen, die sich sonst nicht bilden würden und die mindestens 7 Tage lang stabil bleiben. Das Ausmaß der vaskulären Netzwerkbildung lässt sich leicht quantifizieren. Dieses Modell kann auf eine osteogene Knochenmarksnische abgestimmt werden, indem das Nährmedium mit dem knochenmorphogenetischen Protein 2 (BMP-2) ergänzt wird, das die osteogene Differenzierung der hBM-MSCs fördert, was durch eine erhöhte Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) an Tag 4 und Tag 7 der Kokultur beurteilt wird. Dieses zelluläre Modell kann als Plattform genutzt werden, um verschiedene Krebszellen zu kultivieren und zu untersuchen, wie sie mit knochen- und knochenmarkspezifischen Gefäßnischen interagieren. Darüber hinaus eignet es sich für die Automatisierung und High-Content-Analysen, was bedeutet, dass es das Screening von Krebsmedikamenten unter hochreproduzierbaren Kulturbedingungen ermöglichen würde.

Einleitung

Der Knochen und das Knochenmark sind strukturell und funktionell komplexe Organe, die für die menschliche Gesundheit von zentraler Bedeutung sind. Dies spiegelt sich in der Existenz unterschiedlicher Nischen wider, die die Hämatopoese und den Knochenerhalt regulieren1. Es ist heute allgemein anerkannt, dass im gesunden Knochenmark der Erhalt und die Expansion von hämatopoetischen und skelettalen Stammzellen sowie ihrer Nachkommen durch bestimmte Nischen gesteuert werden. Diese Nischen umfassen verschiedene Zelltypen, darunter Osteolinienzellen, mesenchymale Stammzellen, Endothel- und Perivaskulärzellen, neuronale und Gliazellen, Adipozyten, Osteoklasten, Makrophagen und Neutrophile2. Es überrascht nicht, dass diese meist mit Gefäßen assoziierten Nischen auch an der Entstehung verschiedener Arten von Leukämie beteiligtsind 3 und der Ort der Metastasierung für verschiedene Krebsarten sind4. Aufgrund seiner spezifischen Rolle bei der Knochenbildung, dem Umbau und der Erhaltung des Knochenmarks (Knochenmarks) weist das knochenassoziierte Gefäßsystem ausgeprägte spezialisierte Strukturen auf, die sich von den Gefäßen unterscheiden, die anderswo im Körper zu finden sind 5,6,7. Daher können anti-angiogene oder gefäßmodulierende Medikamente, die systemisch angewendet werden, in diesen spezialisiertenUmgebungen unterschiedliche Wirkungen haben 8. Daher sind Modelle zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die an der Aufrechterhaltung der physiologischen Eigenschaften des Knochens und des Knochenmarks, der Regeneration von Knochen und Knochenmark und dem Ansprechen auf therapeutische Behandlungen beteiligt sind, sehr wünschenswert.

Klassische zweidimensionale (2D) Gewebekulturen und In-vivo-Untersuchungen an Tiermodellen haben unschätzbare Einblicke in die Rolle verschiedener Zellen und molekularer Akteure gegeben, die an der Entwicklung von Knochen und Knochenmark beteiligt sind 9,10. Modelle, die Hochdurchsatzexperimente mit relevanten menschlichen Zellen ermöglichen, könnten unser Verständnis dafür verbessern, wie ausgewählte Parameter in diesen hochkomplexen Systemen moduliert werden können.

In den letzten zehn Jahren wurden aus dem Tissue Engineering abgeleitete Prinzipien zur Erstellung von 3D-Gewebemodellen eingesetzt11,12. Diese beruhten meist auf der Verkapselung geweberelevanter Zellen in Biomaterialien, um 3D-Mono- oder Co-Kulturen zu etablieren13. Zu den am häufigsten verwendeten Biomaterialien gehören Fibrin14, Kollagen 15 und Matrigel16,17, die alle hochgradig biokompatibel sind und geeignete Bedingungen für das Wachstum vieler Zelltypen bieten. Diese Biomaterialien sind in der Lage, In-vitro-Modelle zu generieren, die Schlüsselaspekte der verschiedenen vaskulären Nischen in vivo rekapitulieren 18. Darüber hinaus hat die Verwendung von mikrofluidischen Geräten zur Erzeugung von perfundierten vaskulären Knochen- und Knochenmarkmodellen zur Erzeugung von In-vitro-Modellen höherer Komplexität beigetragen 19,20,21,22.

Die Schwierigkeit, die Zusammensetzung zu kontrollieren und die Eigenschaften natürlich vorkommender Biomaterialien zu beeinflussen, hat die Entwicklung synthetischer Analoga inspiriert, die rational mit vorhersagbaren physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften entworfen werden können23,24. Wir haben vollsynthetische, mit Faktor XIII (FXIII) vernetzte Hydrogele auf Basis von Poly(ethylenglykol) (PEG) entwickelt, die mit RGD-Peptiden und Matrix-Metalloproteasen (MMP)-Spaltstellen funktionalisiert sind, um die Zellanhaftung und den Zellumbau zu erleichtern25,26. Der modulare Aufbau dieser Biomaterialien wurde erfolgreich eingesetzt, um die Bedingungen für die Bildung von 3D-vaskularisiertem Knochen und Knochenmarkmodellen zu optimieren27,28.

Für die Erprobung einer größeren Anzahl unterschiedlicher Kulturbedingungen und neuer Therapeutika werden Modelle mit einer höheren Durchsatzfähigkeit benötigt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die FXIII-Vernetzung unseres PEG-Hydrogels durch einen elektrochemischen Prozess so gesteuert werden kann, dass ein tiefer Hydrogel-Steifigkeitsgradient gebildet wird29. Wenn Zellen auf solche Hydrogele aufgesetzt werden, wandern sie ins Innere und entwickeln sich allmählich zu hochgradig vernetzten zellulären3D-Netzwerken 30. Der Wegfall der Verkapselung von Zellen in das Hydrogel, die normalerweise bei anderen 3D-Gerüsten vorhanden ist, vereinfacht nicht nur das experimentelle Design, sondern ermöglicht auch die sequentielle Zugabe verschiedener Zelltypen zu verschiedenen Zeitpunkten, um komplexe Co-Kultursysteme zu erzeugen. Diese Hydrogele sind vorgegossen auf 96-Well-Speicherfolien mit Glasboden erhältlich, wodurch die Etablierung von 3D-Kulturen sowohl durch manuelle als auch durch automatisierte Zellaussaatprotokolle möglich ist. Die optische Transparenz der PEG-Hydrogele macht die Plattform mit der Mikroskopie kompatibel.

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Generierung und Charakterisierung vaskularisierter osteogener Nischen innerhalb dieser gebrauchsfertigen, synthetischen Plug-and-Play-Plattform vor. Wir zeigen, dass die Entwicklung vaskulärer Netzwerke mit einem Wachstumsfaktor stimuliert werden kann, der üblicherweise zur Induktion der in vitro Osteogenese verwendet wird, dem knochenmorphogenetischen Protein-2 (BMP-2), während die osteogene Differenzierung durch die Supplementierung von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) verhindert werden kann27,31. Die gebildeten Netzwerke unterscheiden sich im Vergleich zu FGF-2-stimulierten Netzwerken in Bezug auf das Gesamterscheinungsbild sowie die Zell- und EZM-Verteilung. Darüber hinaus wurde die osteogene Induktion mit Hilfe der alkalischen Phosphatase als Marker überwacht. Wir demonstrieren die erhöhte Expression dieses Markers über die Zeit und vergleichen die Expression mit der in FGF-2-stimulierten Netzwerken mit qualitativen und quantitativen Methoden. Abschließend zeigen wir die Eignung der generierten Nischen dieses Modells für zwei potentielle Anwendungen. Zunächst führten wir einen Proof-of-Concept-Test zur Arzneimittelsensitivität durch, indem wir Bevacizumab zu vorgeformten Nischen hinzufügten und den Abbau der vaskulären Netzwerke in seiner Gegenwart überwachten. Zweitens fügten wir MDA-MB-231 Brustkrebs- und U2OS-Osteosarkomzellen zu vorgeformten osteogenen Nischen hinzu, was zeigt, dass die Nischen genutzt werden können, um Interaktionen zwischen Krebszellen und ihrer Umgebung zu untersuchen.

Protokoll

Abbildung 1 fasst die folgenden Protokollabschnitte zusammen.

1. Etablierung der 3D-Stroma-Monokultur

  1. Bereiten Sie die hBM-MSC-Zellsuspension vor.
    1. Kultivieren Sie hBM-MSCs bis zu einem Konfluenzniveau von 70 % bis 90 % in MEMα, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 5 ng/ml FGF-2 in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre. Die Zellen können bis zur Passage 6 verwendet werden.
    2. Waschen Sie die Zellen mit PBS und lösen Sie sie mit 0,05% Trypsin-EDTA für 3-5 min bei 37 °C. Stoppen Sie den Ablösungsprozess durch Spülen mit basalem Medium (MEMα ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin). Sammeln Sie die suspendierten Zellen in einem konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
    3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämatozytometer oder einem automatischen Zellzähler und bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Suspension.
    4. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
    5. Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen Basalmedium, um eine Konzentration von 1 x 107 Zellen/ml Stammlösung zu erreichen.
    6. Bereiten Sie konische 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor, die das erforderliche Volumen an Basalmedium enthalten, das mit den entsprechenden Wachstumsfaktoren (FGF-2 und BMP-2 in definierten Konzentrationen, z. B. 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml oder 200 ng/ml) ergänzt wird. Pro Well werden 200 μL benötigt. Wenn die Zellaussaat mit einem automatisierten Liquid-Handler durchgeführt werden soll, berücksichtigen Sie auch das Totvolumen des Geräts. Für die manuelle Zellaussaat ist ein Volumenüberschuss von 10 % ausreichend.
    7. Die hBM-MSCs werden aus der Stammlösung in einer Verdünnung von 1:66,67 zugegeben, um eine Konzentration von 1,5 x 105 Zellen/ml zu erreichen.
  2. Bereiten Sie die Platte für die Aussaat vor.
    1. Entfernen Sie die Polypropylen-Klebefolie, die die 96-Well-Hydrogelplatte bedeckt.
    2. Saugen Sie den Speicherpuffer, der die Hydrogele bedeckt, vorsichtig ab. Verwenden Sie für diese Aufgabe einen Mikrotiterplatten-Washer; Eine manuelle Handhabung ist jedoch möglich.
      1. Wenn Sie einen manuellen Sauger oder eine Mehrkanalpipette verwenden, positionieren Sie die Spitze an der Wand der Vertiefung und bewegen Sie sich langsam nach unten zum Rand der inneren Vertiefung, während Sie den Puffer absaugen. Dadurch wird eine Beschädigung der Hydrogel-Oberfläche vermieden.
      2. Bei Verwendung einer automatischen Plattenwaschanlage stellen Sie die Aspirationsdüsen mindestens 3,8 mm vom Plattenträger (dies entspricht 0,8 mm vom Innenring der Hydrogelplatte) und zum Rand der Vertiefung hin ein. Im Handbuch des Herstellers finden Sie detailliertere Anweisungen und die Plattenzeichnungen der 96-Well-Hydrogelplatte.
  3. Nach gründlichem Mischen werden 200 μl/well der in Schritt 1.1.7 hergestellten Zellsuspension zugegeben, um sicherzustellen, dass die Zellen homogen verteilt sind. Um eine ungleichmäßige Sedimentation der Zellen in einem Bereich des Substrats zu vermeiden, sollten Sie die Platte während der Aussaat nicht kippen. Mischen Sie bei der manuellen Aussaat regelmäßig die Zellsuspension (nach der Aussaat von drei Vertiefungen), um die Mischung homogen zu halten. Für die automatische Aussaat wird unmittelbar vor der Abgabe mit einer serologischen Pipette gemischt, um Volumina mit gleicher Anzahl von Zellen zu dosieren.
  4. Bewahren Sie die Kulturen bei 37 °C und 5 % CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre auf.
  5. Überwachen Sie die Entwicklung der Kulturen durch Hellfeldmikroskopie mit einem 5x-Objektiv nach Wunsch. Erfassen Sie etwa 30 Minuten nach der Aussaat Referenzbilder, um die Anzahl der hinzugefügten Zellen zu bewerten.

2. Etablierung der 3D-Stroma-Endothelzell-Kokultur

  1. Bereiten Sie die GFP-HUVEC-Zellsuspension vor.
    1. Bereiten Sie die Kolben für die HUVEC-Kultur vor, indem Sie sie mit einer Lösung bestehend aus 150 μg/ml Rattenschwanz-Kollagen I in 0,02 M Essigsäure für 30 min bei 37 °C beschichten. Vor Gebrauch einmal mit PBS ausspülen.
    2. Kultivieren Sie die GFP-HUVECs bis zu einem Konfluenzniveau von 80%-100% in EGM-2 ergänzt mit 10% FBS in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre. Die Zellen können bis zum Durchgang 7 verwendet werden.
    3. Waschen Sie die Zellen mit PBS und lösen Sie sie mit 0,05% Trypsin-EDTA für 2-3 min bei 37 °C. Stoppen Sie den Ablösungsprozess durch Spülen mit basalem Medium (MEMα ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin). Sammeln Sie die suspendierten Zellen in einem konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
    4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämatozytometer oder einem automatischen Zellzähler und bestimmen Sie die Gesamtzahl der in der Suspension vorhandenen Zellen.
    5. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
    6. Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen Basalmedium, um eine Konzentration von 1 x 107 Zellen/ml Stammlösung zu erreichen.
    7. Es werden 50 ml konische Zentrifugenröhrchen hergestellt, die das erforderliche Volumen an Basalmedium enthalten, das mit den entsprechenden Wachstumsfaktoren (FGF-2 und BMP-2 in definierten Konzentrationen, z. B. 0 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml oder 200 ng/ml) ergänzt wird, wie für die hBM-MSCs in Schritt 1.1.6 beschrieben.
    8. Die GFP-HUVECs aus der Stammlösung werden in einer Verdünnung von 1:66,67 zugegeben, um eine Konzentration von 1,5 x 105 Zellen/ml zu erreichen, wie für die hBM-MSCs in Schritt 1.1.7 beschrieben.
  2. Das Medium wird von der Platte, die die stromale Monokultur enthält, abgesaugt, wie für die Pufferentfernung in Schritt 1.2.2 beschrieben.
  3. Fügen Sie 200 μl/well der in Schritt 2.1.8 hergestellten GFP-HUVEC-Zellsuspension hinzu, wie für die hBM-MSC-Zugabe in Schritt 1.3 beschrieben.
  4. Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 in befeuchteter Atmosphäre. Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage.
  5. Überwachen Sie die Entwicklung der Kultur durch Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie mit einem 5x-Objektiv nach Wunsch. Bewahren Sie die Kulturen bis zum 4. oder 7. Tag der Co-Kultur für frühe bzw. mittlere Charakterisierungen oder wie gewünscht auf.

3. Charakterisierungsverfahren 1: Quantifizierung der Bildung von Endothelzellnetzwerken

  1. Erfassen Sie zu den gewünschten Zeitpunkten das GFP-Signal von den GFP-HUVECs mit Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Einstellungen, die für die Quantifizierung geeignet sind (d. h. bester Fokus, hoher Kontrast und niedrige Vergrößerung [z. B. 5x] für größere Sichtfelder).
  2. Verarbeiten Sie alle am selben Tag aufgenommenen Bilder gleichmäßig vor (z. B. mit Fiji32), um den Kontrast weiter zu verbessern. Beachten Sie, dass das GFP-Signal mit der Kulturzeit dunkler werden kann. Daher müssen Bilder, die an verschiedenen Tagen aufgenommen wurden, möglicherweise unterschiedlich verarbeitet werden.
    1. Wenn Sie Fidschi oder ImageJ verwenden, öffnen Sie alle GFP-Kanalbilder desselben Zeitpunkts und öffnen Sie das Menü Helligkeit & Kontrast . Wählen Sie ein Bild aus, das eine Zwischenbedingung darstellt (nicht das dunkelste und nicht das hellste Signal), und passen Sie den Kontrast automatisch an, indem Sie Auto auswählen. Wählen Sie " Festlegen" aus, und aktivieren Sie die Option "An alle anderen geöffneten Images weitergeben".
    2. Beurteilen Sie visuell, ob der automatisch ausgewählte Bereich zu allen Bildern des aktuellen Zeitpunkts passt, und passen Sie ihn bei Bedarf manuell an und übertragen Sie ihn erneut auf alle Bilder.
    3. Speichern Sie die angepassten Bilder als TIF-Dateien und wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 und 3.2.2 für die anderen erfassten Zeitpunkte.
  3. Wenden Sie einen mittleren Unschärfefilter (z. B. Radius 3 für Bilder mit einer Auflösung von 2048 x 2048) auf alle Bilder an, um die nachgelagerte Erkennung von Artefakten zu vermeiden und so eine genaue Netzwerkidentifikation zu ermöglichen. Reduzieren Sie die Größe durch Binning (2x2) und speichern Sie alle vorverarbeiteten Bilder als Graustufen-RGB-Farb-TIF-Dateien zur Quantifizierung in einem Ordner. Diese Schritte können manuell oder im Batch-Modus mithilfe von Makros durchgeführt werden, die die Autoren auf Anfrage freigeben.
  4. Analysieren Sie alle Bilder in dem Ordner, der in den Schritten 3.1 bis 3.3 erstellt wurde, im Batch-Prozessmodus im Angiogenesis Analyzer for ImageJ33. Beachten Sie, dass dies je nach Größe der Bilder und verfügbarem Arbeitsspeicher einige Minuten pro Bild dauern kann.
  5. Validieren Sie die Quantifizierungsergebnisse, indem Sie die Überlagerungen der erkannten Strukturen und der Originalbilder untersuchen. Wenn der Algorithmus künstliche Strukturen erkennt, bei denen nur wenige oder keine Zellen im Originalbild zu sehen sind, passen Sie die Vorverarbeitungsparameter an und analysieren Sie die Originalbilder erneut, oder schließen Sie solche problematischen Bereiche aus und/oder replizieren Sie Bilder von der Analyse.
  6. Normalisieren Sie die erhaltenen Werte auf einen Bereich von 1 mm 2, indem Sie die Werte jeder Probe mit dem Verhältnis des analysierten Bereichs zu 1 mm2 multiplizieren. Dieser Schritt ist besonders wichtig, wenn Bilder unterschiedlicher Größe verwendet werden.
  7. Extrahieren Sie verschiedene Netzwerkparameter, wie z. B. die Gesamtlänge des Netzwerks, die Anzahl der Knoten, die Anzahl der Segmente, die Anzahl der isolierten Segmente, das Verzweigungsintervall und die mittlere Maschenweite, aus der Analyse, und verwenden Sie sie, um das Endothelnetzwerk zu verschiedenen Zeitpunkten und unter verschiedenen Kulturbedingungen zu charakterisieren.

4. Charakterisierungsverfahren 2: Beurteilung der ECM-Abscheidung

  1. Zu den gewünschten Endzeitpunkten ist die ECM-Abscheidung mittels Immunfluoreszenz zu beurteilen. Fügen Sie während der letzten 6 Stunden der Kultur oder nach der Fixierung Primärantikörper gegen verschiedene EZM-Moleküle in 100 μl des Nährmediums hinzu, wie unten beschrieben.
    1. Waschen Sie die Kulturen einmal mit 200 μl/Well PBS für 5 min bei RT und fixieren Sie sie mit 100 μl/well 4% Paraformaldehyd unter einem chemischen Abzug für 30 min bei RT. Beachten Sie, dass es ratsam ist, alle Vertiefungen einer Platte gleichzeitig zu fixieren, da die umliegenden Kulturen während dieses Schritts beschädigt werden können. Waschen Sie die fixierten Kulturen dreimal mit 200 μl/well PBS bei RT für jeweils 5 min und lagern Sie sie bei 4 °C in 200 μl/well PBS oder fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
    2. Vor der Inkubation mit Primärantikörpern gegen EZM-Moleküle nach der Fixierung werden die fixierten Kulturen mit 200 μL/Well von 1% BSA in PBS als Blockierungslösung für 30 min bei RT inkubiert.
      1. Die Blockierungslösung wird abgesaugt und mit 100 μl/Well der primären Antikörperlösung in 1% BSA in PBS über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie dreimal mit 200 μl PBS für 5 min, mindestens 3 h bzw. 5 min bei RT.
        HINWEIS: Der lange Waschschritt ist für die vollständige Diffusion des ungebundenen Antikörpers aus dem Hydrogel erforderlich.
    3. Um das Eindringen der sekundären Färbelösung, einschließlich intrazellulärer Gegenfärbungen, zu erleichtern, permeabilisieren Sie die Kulturen mit 0,3 % Triton X-100 und 1 % BSA in PBS für 30-90 min bei RT, abhängig von der zellulären Dichte der Kulturen.
      HINWEIS: Für die antikörperbasierte Färbung intrazellulärer Moleküle sollte dieser Schritt vor der Inkubation mit dem in Schritt 4.1.2 beschriebenen primären Antikörper durchgeführt werden.
    4. Sekundärfärbelösungen mit den entsprechenden Sekundärantikörpern und Gegenfärbungen nach Wunsch herstellen (z. B. eine Kernfärbung wie DAPI und eine Zytoskelettfärbung wie Phalloidin-Rhodamin).
      1. Bereiten Sie einen Färbepuffer aus 0,1 % Triton X-100, 1 % BSA in PBS und Gegenfärbungen (z. B. 1 μg/ml DAPI und 1:4.000 Phalloidin-Rhodamin) vor und fügen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper in den empfohlenen Verdünnungen hinzu.
      2. Fügen Sie 100 μl/Well der sekundären Färbelösung hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Ähnlich wie nach der Inkubation des primären Antikörpers dreimal mit 200 μl/Well PBS für 5 min, mindestens 3 h bzw. 5 min bei RT waschen.
    5. Für die 3D-Auflösung der Strukturen erfassen Sie konfokale Stapel beginnend am Glasboden mit einem z-Schritt von 2,5 μm und einer Endhöhe von 500 μm, verwenden Sie ein 10-faches Objektiv und einen 0,75-fachen Digitalzoom. Um eine 3D-Rekonstruktion des GFP- und F-Aktin-Signals in Fidschi zu erzeugen, legen Sie jeden Kanal separat fest, bevor Sie ein Komposit erstellen und die Rekonstruktion mit Fiji 3D Viewer generieren.
    6. Für die Visualisierung der abgeschiedenen EZM aus den Immunfärbungen werden konfokale Stacks mit einer Höhe von 100 μm und einem z-Schritt von 5 μm, ein 10-faches Objektiv und ein 1,5-facher Digitalzoom aufgenommen. Erzeugen Sie Projektionen mit maximaler Intensität und passen Sie Helligkeit und Kontrast für jeden Kanal in Fidschi separat an, bevor Sie eine Komposition erstellen.
  2. Führen Sie direkte Farbfärbungen der extrazellulären Umgebung durch.
    1. 200 μl/Well der Picrosirius-Rot-Färbelösung in die paraformaldehydfixierten Vertiefungen geben und 1 h bei RT inkubieren.
    2. Waschen Sie anschließend die verschmutzten Vertiefungen fünfmal mit destilliertem Wasser, gefolgt von einem zweimaligen Waschen zweimal täglich oder jeden zweiten Tag für 3-4 Tage, während Sie die Farbreinigung der Probe überwachen. Halten Sie die Platten während der langen Waschschritte (d. h. alles, was länger als 6 h dauert) bei 4 °C.
    3. Nehmen Sie Bilder der gefärbten Proben mit einem Hellfeldmikroskop auf, das mit einer Farbkamera ausgestattet ist, und sorgen Sie für einen gleichmäßigen Weißabgleich unter allen Bedingungen. Um einen Überblick über die Proben zu erhalten, verwenden Sie eine niedrige Vergrößerung (z. B. 2,5-fach), um die gesamte Vertiefung zu scannen. Wenn das Mikroskop nicht mit Software geliefert wird, die automatisiertes Stitching unterstützt, führen Sie dies manuell durch (z. B. mit Pairwise Stitching in Fiji34).
      HINWEIS: Die bisher für die Immunfluoreszenz verwendeten Wells können dafür verwendet werden, sofern die Fluoreszenzbildaufnahme abgeschlossen ist.
    4. Befolgen Sie die gleichen Schritte, die für die Färbung von Picrosiriusrot in den Schritten 4.2.1-4.2.3 beschrieben sind, um die Färbung, das Waschen und die Bildgebung von Alizarinrot durchzuführen.

5. Charakterisierungsverfahren 3: Beurteilung der osteogenen Differenzierung durch Monitoring der ALP-Aktivität

  1. Zu verschiedenen Kulturendzeitpunkten (z. B. Tag 4 und Tag 7 der Co-Kultur) wird die ALP-Aktivität quantitativ mit Hilfe von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)/Nitroblautetrazolium (NBT)-Färbung bewertet.
    1. Waschen Sie die Kulturen einmal mit 200 μl/Well PBS, bevor Sie sie mit der BCIP/NBT-Substratlösung inkubieren, die gemäß den Anweisungen des Herstellers zubereitet werden sollte. Inkubieren bei 37 °C unter regelmäßiger Überwachung der Farbentwicklung. Sobald sich die Farbe unter nicht-osteogenen Bedingungen zu entwickeln beginnt, sofort einmal mit 200 μl/Well PBS waschen, bevor sie mit 4%igem Paraformaldehyd fixiert wird, wie in Schritt 4.1.1 beschrieben.
    2. Erfassen Sie Farbbilder der gefärbten Proben, wie in Schritt 4.2.3 für die Picrosirius-Rot-Färbung beschrieben.
  2. Zu verschiedenen Kulturendzeitpunkten (z. B. Tag 4 und Tag 7 der Co-Kultur) wird die ALP-Aktivität in den Zelllysaten quantifiziert.
    1. Waschen Sie die Kulturen dreimal mit 200 μL/Well PBS, bevor Sie sie mit 200 μL/Well 0,25% Trypsin-EDTA bei 37 °C inkubieren. Rühren Sie die Kulturen alle 10 Minuten kräftig auf und ab, um die Verdauung zu erleichtern, und überwachen Sie die Kulturmorphologie mit einem Standard-Zellkulturmikroskop.
    2. Sobald eine flüssige, einzellige Suspension ohne längliche Zellstrukturen in den Vertiefungen erhalten wurde (in der Regel nach 20-30 Minuten), werden die Proben in 2-ml-Röhrchen überführt, 200 μl MSC-Basalmedium hinzugefügt, um das Trypsin zu hemmen, und 5 Minuten lang bei 500 x g zentrifugiert, um die gewonnenen Zellen zu pelletieren. Den Überstand umfüllen und die Pellets bei −80 °C einfrieren oder direkt mit Schritt 5.2.3 fortfahren.
    3. Die in Schritt 5.2.2 erhaltenen Zellpellets werden aufgetaut und mit 500 μl Lysepuffer, bestehend aus 0,56 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol, 0,2 % Triton X-100, pH 10, für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wird bei 16.100 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert und die Proben auf Eis gelegt. Nach den in Schritt 5.2.7 beschriebenen Messungen werden die Proben bei −20 °C oder −80 °C eingefroren oder direkt mit der DNA-Quantifizierung fortgesetzt, wie in Schritt 5.2.8 beschrieben.
      HINWEIS: Der Lysepuffer kann im Voraus vorbereitet, sterilfiltriert und bei 4 °C gelagert werden.
    4. Das ALP-Reagenz besteht aus 20 mM 4-Nitrophenylphosphat-Dinatriumsalz-Hexahydrat und 4 mMMgCl2 in Lysepuffer.
      HINWEIS: Es ist am besten, diese Lösung am Tag der Quantifizierung frisch zuzubereiten.
    5. Ohne die pelletierten Ablagerungen zu stören, werden 50 μl des in Schritt 5.2.3 hergestellten Zelllysatüberstandes in die Vertiefungen einer standardmäßigen, transparenten Gewebekulturplatte mit 96 Wells in Duplikaten abgegeben. Fügen Sie den Lysepuffer zu zwei Vertiefungen als leere Steuerelemente hinzu.
    6. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 μl/Well ALP-Reagenz in die in Schritt 5.2.5 gefüllten Wells. Den Teller kurz schütteln und bei 37 °C 10 min lichtgeschützt inkubieren. Vertiefungen mit höherer ALP-Aktivität werden gelb angezeigt. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 μl/Well von 1 M NaOH mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen.
    7. Lesen Sie die optische Dichte bei 410 nm mit einem Plattenleser ab. Ermitteln Sie den Mittelwert der technischen Duplikate und subtrahieren Sie den Durchschnitt der leeren Steuerelemente.
    8. Führen Sie eine DNA-Quantifizierung durch, um die in den vorherigen Schritten ermittelte ALP-Aktivität anhand der Gesamtzellzahl zu normalisieren. Hier wird eine Methode beschrieben, die auf Fluoreszenzmessungen basiert, aber jede andere Methode zur DNA-Quantifizierung in Zelllysaten ist mit dem Assay kompatibel. Bereiten Sie die für die DNA-Quantifizierung erforderlichen Reagenzien und DNA-Standards mit handelsüblichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, Lysepuffer für die Herstellung der DNA-Standards zu verwenden.
    9. Wenn die für die ALP-Quantifizierung gemäß Schritt 5.2.3 verwendeten Proben eingefroren waren, tauen Sie sie auf, zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 4 °C bei 16.100 x g und legen Sie sie auf Eis. Geben Sie 50 μl des Zelllysatüberstandes in Duplikate in die Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte, ohne diese zu stören. Frieren Sie die Proben bei −20 °C oder −80 °C ein und wiederholen Sie bei Bedarf die ALP- und DNA-Quantifizierungen. Fügen Sie die DNA-Standards in Duplikaten hinzu.
    10. Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 μl des DNA-Färbemittels hinzu, inkubieren Sie es und lesen Sie die Fluoreszenzintensität gemäß den Anweisungen des Herstellers ab. Ermitteln Sie anhand der Standardkurvenwerte die Umrechnung der gemessenen Intensitätswerte auf die DNA-Konzentrationen und wenden Sie sie an.
    11. Die in Schritt 5.2.7 erhaltenen ALP-Werte sind zu normalisieren, indem sie durch die jeweilige DNA-Konzentration jeder Probe dividiert werden.

6. Anwendung 1: Durchführung von Medikamentensensitivitätstests

  1. Wenn die Endothelnetzwerke vollständig entwickelt sind (typischerweise an Tag 4 der Stroma-Endothelzell-Kokulturen), fügen Sie den Kulturen anti-angiogene Verbindungen wie Bevacizumab in frischem Nährmedium hinzu und testen Sie ihre Aktivität über die Zeit und unter verschiedenen Bedingungen (z. B. unterschiedliche Konzentrationen von FGF-2 oder BMP-2).
    1. Bereiten Sie frisches Nährmedium vor, das die gleichen Wachstumsfaktoren enthält, die bis dahin für die jeweiligen Kulturen verwendet wurden.
      1. Stellen Sie eine Kontrolllösung her, die aus dem Verdünnungsmittel der interessierenden Verbindung besteht (z. B. für Bevacizumab: 60 mg/ml α-Trehalose-Dihydrat, 0,4 mg/ml Tween20, 5,8 mg/ml Natriumphosphat, einbasisch und monohydrat, und 1,2 mg/ml Natriumphosphat zweibasisch, wasserfrei), und sterilfiltrieren Sie sie.
      2. Geben Sie die zu untersuchende Verbindung in der gewünschten Konzentration (z. B. 10 μg/ml Bevacizumab) und ein gleiches Volumen der Kontrolllösung zu dem für die Test- bzw. Kontrollbedingungen bestimmten Nährmedium.
  2. Das Medium wird aus der Kultur abgesaugt und 200 μl/well des in Schritt 6.1.1 frisch zubereiteten Mediums hinzugefügt. Inkubationszeit für eine Zeit, die für die zu testende Verbindung geeignet ist (z. B. für Bevacizumab: 2 Tage). Überwachen Sie die Kulturentwicklung und charakterisieren Sie die endothelialen Netzwerke, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Beurteilen Sie die Wirksamkeit der Verbindung bei der Hemmung der Angiogenese oder der Ablation der vorgeformten Strukturen anhand der GFP-Bilder und der quantitativen Netzwerkparameter, die aus der in Schritt 3.7 beschriebenen Analyse extrahiert wurden.

7. Anwendung 2: Etablierung fortschrittlicher Co-Kultursysteme mit verschiedenen Krebszelltypen

  1. An Tag 4 der Co-Kultur, wenn die Endothelnetzwerke größtenteils etabliert sind, fügen Sie den Kulturen in frischem Nährmedium andere Zelltypen hinzu, wie z. B. MDA-MB-231 oder U2OS-Krebszellen.
    1. Markierung der Krebszellen mit einem zellverträglichen Lebendfarbstoff gemäß Herstellerangaben, um sie von den GFP-markierten HUVECs und unmarkierten hBM-MSCs in den Co-Kulturen unterscheiden zu können.
    2. Bereiten Sie eine Suspension von Krebszellen in einer Konzentration von 1,5 x 104 Zellen/ml in frischem Nährmedium vor, das die gleichen Wachstumsfaktoren enthält, die bis zu diesem Zeitpunkt für die jeweiligen Kulturen verwendet wurden.
  2. Überwachen Sie die Kulturentwicklung und die Lokalisierung von Krebszellen wie gewünscht.
    HINWEIS: Je nach Krebsart, -aktivität und -umgebung kann es einige Tage dauern, bis sie die Gefäßstrukturen in den Stroma-Endothel-Zell-Kokulturen erreichen (z. B. 2 Tage für MDA-BM-231 und U2OS). Daher sollte die Zeitraffer-Bildgebung zur Visualisierung der Interaktionen zwischen Krebs und Gefäßzellen entsprechend getimt werden.

Repräsentative Ergebnisse

Vaskuläre Nischenkulturen wurden durch sequentielle Aussaat von hBM-MSCs und GFP-HUVECs auf vorgegossene PEG-basierte Hydrogele mit einem Steifigkeitsgradienten innerhalb einer 96-Well-Bildgebungsplatte etabliert (Abbildung 1). Die Kulturen wurden longitudinal mittels Live-Epifluoreszenzmikroskopie beobachtet und zu ausgewählten Zeitpunkten weiter charakterisiert. Das extrazelluläre Kompartiment wurde mittels direkter Farbfärbung und Antikörper-basierter Färbung beurteilt. Die ALP-Aktivität wurde nach der Entnahme und Lyse der Zellen aus den generierten Nischen quantifiziert. Darüber hinaus demonstrieren wir die Eignung dieser Plattform für anti-angiogene Wirkstoffsensitivitätsassays und als Grundlage für Krebs-Co-Kulturmodelle.

Kokulturen von hBM-MSCs und GFP-exprimierenden HUVECs wurden durch Aussaat von 3 x 104 Zellen/Well in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren oder in Gegenwart von FGF-2 oder BMP-2 bei 50 ng/ml hergestellt, wie im Protokoll beschrieben. Schon früh konnten Unterschiede zwischen den Kulturen sowohl aus den Hellfeld- als auch aus den Fluoreszenzbildern beobachtet werden, die nur die GFP-HUVECs zeigten (Abbildung 2A). Durch die Beobachtung der gleichen Gebiete im Längsschnitt konnten Unterschiede in der Entwicklung der Kulturen festgestellt werden, wie z.B. eine schnellere Entwicklung in Gegenwart von FGF-2. Im Allgemeinen schienen die Kulturen weniger entwickelt zu sein, da kein Wachstumsfaktor vorhanden war, wobei sich weniger Zellen beider Typen ausbreiteten und azelluläre Bereiche vorhanden waren. Im Gegensatz dazu zeigten die Hellfeldbilder die dichtesten Kulturen in Gegenwart von BMP-2. Allerdings bildeten sich vaskuläre Netzwerke sowohl unter Wachstumsfaktor-haltigen Bedingungen, als auch die umfangreichsten und miteinander verbundenen Netzwerke mit FGF-2. Diese beobachteten Unterschiede konnten auch mit dem Angiogenesis Analyzer for ImageJ quantifiziert werden. In der Tat war die Gesamtlänge des Netzwerks in Gegenwart von FGF-2 am höchsten und in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren am niedrigsten (Abbildung 2B). Die Anzahl der Knoten, die Verzweigungspunkte in den Netzen anzeigen, folgte dem gleichen Trend wie die Gesamtlänge (Abbildung 2C). Umgekehrt wiesen beide Wachstumsfaktor-haltigen Bedingungen signifikant weniger isolierte Segmente auf, was auf eine höhere Interkonnektivität hindeutet, als die Bedingungen ohne Wachstumsfaktor (Abbildung 2D). Darüber hinaus zeigte die konfokale 3D-Bildgebung eine stärkere Penetration der Endothelzellen in Bezug auf die Tiefe in der FGF-2-stimulierten Bedingung (Abbildung 2E).

hBM-MSC/GFP-HUVEC-Kokulturen wurden 7 Tage lang in Gegenwart von FGF-2 oder BMP-2 gehalten, bevor sie für ECM-Komponenten fixiert und gefärbt wurden. Immunzytochemische Färbungen mit anschließender konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie zeigten auffällige Unterschiede in der Kulturmorphologie in Abhängigkeit von der Art der Wachstumsfaktor-Supplementierung (Abbildung 3A). Mit FGF-2 war die Kultur in kondensierten mikrovaskulären Strukturen organisiert, die sowohl in Endothel- als auch in Mesenchymzellen dicht waren, während sich die hBM-MSCs in Gegenwart von BMP-2 über eine viel größere Fläche erstreckten, wie aus den ausgedehnteren F-Aktin-positiven und GFP-negativen Bereichen hervorgeht. Die EZM-Proteine Fibronektin und Kollagen I waren in ähnlicher Weise lokalisiert, während Laminin und Kollagen IV stärker um die Endothelstrukturen herum konzentriert waren. Diese erhöhte Konzentration um die Endothelstrukturen herum war jedoch in Gegenwart von FGF-2 viel stärker ausgeprägt als in Gegenwart von BMP-2. Zusätzlich zu den Antikörper-basierten Färbungen wurden direkte Farbfärbungen durchgeführt, um den fibrotischen Gesamtzustand der EZM zu beurteilen (Picrosirius-Rot-Färbung; Abbildung 3B) sowie die Abscheidung von Ca auf der ECM (Alizarinrot-Färbung; Abbildung 3C) der gebildeten Nischen. Die Picrosirius-Rot-Färbung war in den mit BMP-2 kultivierten Nischen stärker und umfangreicher, und die Alizarinrot-Färbung folgte dem gleichen Trend.

Anschließend wurden die Kulturen hinsichtlich ihres osteogenen Potenzials charakterisiert, indem die ALP-Aktivität als früher osteogener Marker bewertet wurde. An Tag 4 und Tag 7 der Co-Kultur wurden Zellen aus den Nischen gewonnen, indem die Hydrogele mit Trypsin verdaut wurden. Um die ALP-Aktivität zu quantifizieren, wurden die gewonnenen Zellen lysiert und ein pNPP-Assay durchgeführt. Die erhaltenen Werte wurden gegen die Gesamt-DNA für jede Probe normalisiert, um mögliche Unterschiede in der Zellzahl zwischen den Bedingungen zu berücksichtigen. In der Tat konnten kleine Unterschiede zwischen dem DNA-Gehalt der Erkrankungen beobachtet werden, und die wenigsten Zellen wurden ohne Wachstumsfaktor aus der Erkrankung gewonnen (nicht gezeigt). Die normalisierte ALP-Aktivität variierte jedoch stark zwischen den Bedingungen, mit einem Trend steigender Aktivität mit höheren Konzentrationen von BMP-2 und einem Plateau bei 100 ng/ml (Abbildung 4A,B). Die niedrigsten Aktivitätswerte wurden für die Erkrankung mit 50 ng/ml FGF-2 identifiziert. Während für beide untersuchten Zeitpunkte ähnliche Trends beobachtet werden konnten, stiegen alle Werte im Laufe der Zeit in der Kultur von Tag 4 bis Tag 7 signifikant an. Zusätzlich zum quantitativen Assay konnte die ALP-Aktivität durch direkte Farbfärbung auf Basis der BCIP/NBT-Substratkonversion qualitativ visualisiert werden. In Gegenwart von BMP-2 wurde eine umfangreichere und intensivere violette Färbung im Vergleich zu FGF-2 beobachtet (Abbildung 4C).

Um zwei potentielle Anwendungen der charakterisierten osteogenen Nischen zu demonstrieren, wurden eine Proof-of-Concept-Wirkstoffsensitivitätsstudie und Krebs-Co-Kulturen durchgeführt. Für den Wirkstoffsensitivitätstest wurde Bevacizumab oder eine Kontrolllösung, bestehend aus dem Verdünnungsmittel der Bevacizumab-Formulierung, dem Nährmedium, das frisches BMP-2 enthielt, zugesetzt. An Tag 4, an dem etablierte Netzwerke in Gegenwart von 50 ng/ml BMP-2 gebildet wurden, wurde während des regulären Mediumwechsels entweder die Kontrolllösung oder das Bevacizumab-haltige Medium zugegeben und die Kulturen mittels Fluoreszenzbildgebung überwacht. Die Zugabe von 10 μg/ml Bevacizumab führte zur Retraktion bzw. Ablation des zuvor gebildeten Netzwerks, während die Kontrollbedingung 2 Tage nach dem Mediumwechsel noch ausgedehnte Netzwerke aufwies (Abbildung 5A,B). Diese Veränderungen konnten auch quantifiziert werden, indem die Gesamtlänge der Netzwerke mit dem Angiogenesis Analyzer for ImageJ auf täglich aufgenommenen Fluoreszenzbildern verfolgt wurde (Abbildung 5C). Alternativ könnte auch Bevacizumab oder eine andere Verbindung von Beginn der Co-Kultur an hinzugefügt werden, um ihren Einfluss auf die Bildung der Netzwerke zu beurteilen. Im Falle von Bevacizumab hemmte dies die Bildung von Endothelnetzwerken vollständig (nicht dargestellt).

Für die zweite Anwendung wurden MDA-MB-231 Brustkrebs- oder U2OS-Osteosarkomzellen in Tag-4-Kokulturen mit einer Dichte von 1,5 x 103 Zellen/Well in frischem Nährmedium mit 50 ng/ml BMP-2 hinzugefügt. Um sie von den GFP-markierten HUVECs und den nicht-markierten hBM-MSCs zu unterscheiden, wurden die Krebszellen kurz vor der Aussaat in die osteogenen Nischen mit CellTrace FarRed inkubiert. Die Kulturen wurden fluoreszenzmikroskopisch überwacht; Zu Beginn lokalisierten sich die meisten Krebszellen in der Nähe der Oberfläche des Substrats, aber nach 2 Tagen konnten sie in größerer Nähe zu den Schichten gefunden werden, die die vaskulären Kokulturen enthielten. Daher wurde Tag 2 als Ausgangspunkt für die Zeitraffermikroskopie gewählt, um die Dynamik der Interaktionen zwischen den Krebszellen und den Zellen innerhalb der vaskulären Nische zu zeigen. Interessanterweise konnte man beobachten, wie sich die MDA-MB-231-Zellen sowohl Endothelstrukturen näherten als auch von ihnen entfernten und daher möglicherweise ihre Umgebung sondierten oder umbauten (Abbildung 5D). Mit CellTrace FarRed als Markierung für die Krebszellen, GFP als Markierung für HUVECs und zusätzlicher Färbung für F-Aktin konnten alle Zelltypen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie unterschieden werden (Abbildung 5E).

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Abbildung 1: Ein einfacher Ansatz zur zuverlässigen Generierung vaskularisierter, osteogener Nischen. Vorgegossene synthetische Hydrogele mit einem tiefen Steifigkeitsgradienten ermöglichen die Erzeugung von 3D-Kulturen durch sequentielles Zellseeding, ohne dass eine direkte Verkapselung erforderlich ist. hBM-MSCs werden 3 Tage lang vorkultiviert, bevor GFP-exprimierende HUVECs hinzugefügt werden. Die Kulturen werden durch die Erfassung von Hellfeld- und GFP-Signalen longitudinal überwacht. Zu ausgewählten Zeitpunkten werden die Nischen weiter auf ihre ECM-Ablagerung und ihren osteogenen Zustand untersucht. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wird durch direkte Farbfärbung und durch die Entnahme von Zellen aus den Nischen und die Durchführung eines pNPP-Assays an den Zelllysaten bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: Stimulation vaskulärer Netzwerke mit FGF-2 oder BMP-2. (A) Hellfeld- und Fluoreszenzbilder (GFP) wurden an Tag 2, Tag 4 und Tag 6 der Co-Kultur von Zellen aufgenommen, die in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren oder in Gegenwart von FGF-2 oder BMP-2 gezüchtet wurden, beide bei 50 ng/ml. Maßstabsbalken: 400 μm. (B-D) Quantifizierte Parameter der GFP-HUVEC-Netzwerke, die an Tag 4 der Co-Kultur abgebildet wurden, analysiert mit dem Angiogenesis Analyzer for ImageJ. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.5.1 durchgeführt. Eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest wurde mit n ≥ 4 durchgeführt; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Dreidimensionale Rekonstruktionen, die aus konfokalen Stacks (Gesamthöhe: 547,5 μm; z-Schritt: 2,5 μm) der GFP- und F-Aktin-Signale für die FGF-2- (obere Reihe) und BMP-2- (untere Reihe) stimulierten Bedingungen generiert wurden. Maßstabsbalken: 300 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 3: Induktion der delokalisierten hBM-MSC-Ausbreitung und ECM-Ablagerung durch BMP-2. (A-C) Die 7-tägigen Co-Kulturen, die entweder in Gegenwart von FGF-2 oder BMP-2 gezüchtet wurden, wurden (A) Immunfluoreszenz oder (B,C) direkter Farbfärbung unterzogen. (A) Die Kulturen wurden für F-Aktin und die ECM-Proteine Fibronektin, Laminin, Kollagen I und Kollagen IV gefärbt. Die Bilder zeigen die maximalen Intensitätsprojektionen der konfokalen Stacks (Gesamthöhe: 100 μm; z-Schritt: 5 μm). Maßstabsbalken: 200 μm. (B,C) Die Kulturen wurden mit (B) Picrosiriusrot und (C) Alizarinrot gefärbt. Die obere Reihe zeigt zusammengefügte Gesamtüberblicke der Bilder, die mit 2,5-facher Vergrößerung aufgenommen wurden (Maßstabsleiste: 1.000 μm), während die untere Reihe ein Sichtfeld darstellt, das mit 5-facher Vergrößerung aufgenommen wurde (Maßstabsleiste: 400 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 4: Biochemische Bewertung der BMP-2-induzierten ALP-Aktivität durch direkte Farbfärbung. (A,B) Die ALP-Aktivität wurde in den Zelllysaten von Kulturen bestimmt, die in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren oder in Gegenwart von BMP-2 in unterschiedlichen Konzentrationen oder FGF-2 in 50 ng/ml für (A) 4 Tage oder (B) 7 Tage Co-Kultur. Die ALP-Aktivität wird normalisiert auf den DNA-Gehalt jeder Lysatprobe dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.5.1 durchgeführt. Eine gewöhnliche einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest wurde mit n = 5 durchgeführt; P < 0,0001. (C) Direkte Farbfärbung der ALP-Aktivität in Nischen, die in Gegenwart von 50 ng/ml FGF-2 oder BMP-2 für 7 Tage Co-Kultur gezüchtet wurden. Die Bilder auf der linken Seite zeigen zusammengesetzte Gesamtgutübersichten von Bildern, die mit 2,5-facher Vergrößerung (Maßstab: 1.000 μm) aufgenommen wurden, während die Bilder auf der rechten Seite ein Sichtfeld darstellen, das mit 5-facher Vergrößerung aufgenommen wurde (Maßstab: 400 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 5: Einsatz osteogener, vaskularisierter Nischen in fortgeschrittenen Krebsmodellen. (A) Die GFP-Signale von Kulturen, die in Gegenwart von BMP-2 gezüchtet wurden, wurden an Tag 4 der Co-Kultur abgebildet, bevor eine Kontrolllösung (links) oder Bevacizumab mit 10 μg/ml (rechts) für 2 Tage hinzugefügt wurde, danach wurden die Kulturen erneut abgebildet (Tag 6 der Co-Kultur). Maßstabsbalken: 600 μm. (B) Bilder mit höherer Vergrößerung der mit Bevacizumab behandelten Kulturen sind in A dargestellt. Maßstab: 250 μm. (C) Die Gesamtlänge der Endothelnetzwerke, wie in A gezeigt, wurde mit dem Angiogenesis Analyzer for ImageJ aus täglich aufgenommenen Bildern quantifiziert; Nr. ≥ 3. (D) CellTrace FarRed-markierte MDA-MB-231-Brustkrebszellen wurden zu den 4-tägigen Kokulturen hinzugefügt, die in Gegenwart von BMP-2 gezüchtet wurden, und es wurden Zeitrafferbilder ab 2 Tage nach der Zugabe der Krebszellen aufgenommen. Maßstabsbalken: 100 μm. (E) Maximale Intensitätsprojektionen von konfokalen Stapeln (Gesamthöhe: 70 μm; z-Schritt: 2,4 μm) von Dreifach-Kokulturen, die wie in D beschrieben erzeugt und für F-Aktin fixiert und gefärbt wurden. Links: Nischen mit MDA-MB-231 Brustkrebszellen; rechts: Nischen mit U2OS-Osteosarkomzellen. Maßstabsbalken für Bilder links: 200 μm; Maßstabsbalken für Bilder rechts: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Etablierung eines in vitro Modells von stark vaskularisiertem Knochen und Knochenmarksnischen in einer vollsynthetischen und kontrollierbaren 3D-PEG-basierten Matrix, das eine Vielzahl von Anwendungen in der Knochen- und Knochenmarksbiologie, im Tissue Engineering und in der Krebsforschung hat. Dieses Modell baut auf einem synthetischen Hydrogel auf PEG-Basis auf, das mit RGD-Peptiden und MMP-Spaltstellen funktionalisiert und mit einem tiefen Dichtegradienten auf 96-Well-Speicherfolien mit Glasboden gegossen wird30. Es wurde gezeigt, dass diese Plug-and-Play-Plattform den Aufbau hochgradig vernetzter 3D-Mobilfunknetze ermöglicht, ohne dass Zellen in das Hydrogel eingekapselt werden müssen. Ähnlich wie bei dem zuvor beschriebenen Zellverkapselungsprotokoll zeigen wir in dieser Arbeit den Umbau des Substrats durch eine zellinhärente ECM28 , um eine zelltypspezifische Mikroumgebung zu schaffen. So können mit dieser Methode Arzneimittel-Screening-Assays und High-Content-Analysen unter hochreproduzierbaren, organotypischen 3D-Kulturbedingungen einfach durchgeführt werden. Die 96-Well-Platten mit Glasboden und die optisch transparenten Hydrogele machen die Plattform kompatibel mit der Automatisierung des Liquid Handling und der Hochdurchsatzmikroskopie.

Der erste Schritt zur Erzeugung einer osteogenen vaskulären Knochenmarksnische ist die Vorkultur von hBM-MSCs auf dem PEG-Hydrogel für mindestens 3 Tage. Während dieser Zeit lagern sie sich an das Hydrogel an, dringen in es ein und beginnen mit dem Aufbau von Zell-Zell-Kontakten und der ECM-Abscheidung. Vor der Aussaat der hBM-MSCs muss der Speicherpuffer entfernt werden. Da sich das Hydrogel in einer inneren Vertiefung innerhalb der Standardvertiefung der 96-Well-Belichtungsplatte befindet, ist es sicher, die Aspirationsspitze an der Seite der Vertiefung einzuführen, bis sie den inneren Vertiefungsring berührt. Eine Vakuumpumpe kann zur Absaugung verwendet werden, wenn sie auf eine möglichst geringe Saugkraft eingestellt ist. Alternativ kann eine automatische Plattenwaschanlage mit einer auf mindestens 0,8 mm eingestellten Düsenhöhe über dem inneren Wellring verwendet werden, um den Puffer von der Hydrogelplatte abzusaugen. Durch den Einsatz von Automatisierung für das Liquid Handling kann die Beschädigung der Hydrogeloberfläche minimiert und eine höhere Reproduzierbarkeit der resultierenden Kulturen erreicht werden. Kleine Defekte auf der Hydrogeloberfläche werden sichtbar, sobald sich die Zellen auf dem Hydrogel absetzen, und erscheinen in defekten Hydrogelbereichen auf einer niedrigeren Fokusebene. Daher dient die Aufnahme von Referenzbildern an Tag 0 als gute Qualitätskontrolle für die Homogenität der Zellaussaat und die Integrität der Hydrogeloberfläche. Während kleine Hydrogel-Oberflächendefekte die weitere Verwendung des Wells nicht ausschließen, neigen die Zellen dazu, sich an den defekten Stellen zu bündeln und zu nicht repräsentativen Mustern zu wachsen oder schneller das untere Glas zu erreichen, wo sie zu einer Monoschicht heranwachsen. Diese Artefakte müssen bei der Nutzung/Auswertung dieser Bohrungen beachtet werden. Ähnliche Überlegungen gelten für alle Mediumsänderungen, die während der gesamten Dauer des Assays durchgeführt werden.

Der zweite Schritt des Protokolls beinhaltet die Zugabe von GFP-HUVECs zur vorgeformten hBM-MSC-Monokultur (Tag 0 der Kokultur). Die von der hBM-MSC abgeschiedene EZM bietet ein großartiges Gerüst für das Wachstum von Endothelzellen, die in dieser Arbeit selbst in Gegenwart von hBM-MSC-konditioniertem Medium nur runde Zellcluster auf den Hydrogelen bilden konnten (nicht gezeigt). Nach der Aussaat auf den hBM-MSC-Kulturen integrieren sich die HUVECs und bilden mikrogefäßartige Strukturen, die mit denen vergleichbar sind, die in Kokulturen beobachtet werden, die durch Zellverkapselung erzeugt werden27,28. Typischerweise bilden sich innerhalb von 4 Tagen nach der Kokultur gut entwickelte mikrovaskuläre 3D-Netzwerke, die durch die Verwendung von GFP-markierten HUVECs longitudinal überwacht werden können. Diese Strukturen können mindestens 7 Tage lang in Kultur erhalten bleiben, was bedeutet, dass genügend Zeit bleibt, um Veränderungen in der Organisation des Gefäßnetzwerks als Reaktion auf Behandlungen, z. B. für das Screening von antiangiogenen Medikamenten, zu verfolgen. Die morphologischen Elemente des Endothelnetzwerks können im Batch-Modus quantifiziert werden, indem die GFP-Bilder mit etablierten Werkzeugen, wie dem Angiogenesis Analyzer-Plugin von ImageJ33, segmentiert werden, und ihre Parameter können verwendet werden, um beispielsweise die Wirksamkeit und Pharmakodynamik von Medikamenten zu bewerten.

Ein wesentlicher Vorteil des beschriebenen zellulären Modells für viele mögliche Anwendungen ist seine Plastizität. Allein die Ergänzung des Nährmediums mit verschiedenen Wachstumsfaktoren kann das Erscheinungsbild der Co-Kultur verändern. Zum Beispiel schafft die Anwesenheit von BMP-2 während der Mono- und Co-Kulturperiode eine osteogene vaskuläre Nische, die eine erhöhte ALP-Aktivität, extrazelluläre Kalziumablagerung sowie ECM-Assemblierung und -Ablagerung zeigt. Im Gegenteil, in Gegenwart von FGF-2 fehlen die osteogenen Marker, und die Co-Kultur bildet weniger laterale Zellverbände, zeigt aber ein ausgeprägteres 3D-Zellwachstum. Die Tatsache, dass FGF-2 die ALP-Aktivität unterdrückt, während BMP-2 im Vergleich zu keiner Behandlung mit Wachstumsfaktoren eine stärkere ALP-Aktivität hervorruft, stimmt mit früheren Beobachtungen überein27. Trotz dieser großen Unterschiede in der hBM-MSC-Stromakomponente war das Ausmaß des mikrovaskulären Netzwerks für die beiden mit Wachstumsfaktoren behandelten Erkrankungen in dieser Arbeit sehr ähnlich. In den Kontrollkulturen bildeten sich nur wenige kurze Gefäßnetzwerke, die möglicherweise eine schlecht vaskularisierte Knochenmarksnische darstellen. Dies deutet darauf hin, dass durch einfache Änderung der Art, der Konzentration und des Zeitpunkts der Wachstumsfaktoren, die dem Nährmedium zugesetzt werden, eine Reihe von gut definierten vaskularisierten Knochenmarknischen erzeugt werden könnte, wie sie für vergleichende Studien erforderlich wären. Um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten, ist es jedoch wichtig zu beachten, dass der Kulturverlauf und die Morphologie je nach Vorgeschichte der verwendeten Zellen variieren können (z. B. die Anzahl der Passagen und die Ablösungsmethode, die bei der routinemäßigen Kulturpflege verwendet wird), und es ist ratsam, solche Faktoren während des Assay-Designs zu kontrollieren.

Hier demonstrieren wir als erste Anwendung dieses Modells die Sensitivität der konstruierten mikrovaskulären Netzwerke gegenüber der Behandlung mit 10 μg/ml Bevacizumab. Insbesondere ist es wichtig zu bestätigen, dass der verwendete Algorithmus das Endothelnetzwerk genau erkennen kann, da Artefakte oft in Bildern mit schlecht entwickelten Netzwerken erzeugt werden. Wenn dies der Fall ist, müssen die für die Bildverarbeitung verwendeten Parameter (vor und während der Segmentierung) fein abgestimmt werden, oft nach dem Prinzip von Versuch und Irrtum.

Als zweite Anwendung präsentieren wir ein fortschrittliches Co-Kulturmodell, das durch die sequentielle Aussaat von mesenchymalen, endothelialen und Krebszellen gebildet wird. Dieses Modell ermöglicht es, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen, dem Stroma und dem Gefäßsystem des Knochenmarks zu untersuchen, die wichtige Faktoren während der Metastasierung sein können. Darüber hinaus könnte dieses Modell für das Screening von Medikamenten und zum Testen von Wirkstoffen verwendet werden, deren Ziele über die Angiogenese hinausgehen.

In 2D-Kulturen erhalten Zellen keine physiologischen Mikroumgebungssignale, erwerben keine natürlich vorkommenden Zellmorphologien und differenzieren sich daher anders als Zellen in nativen 3D-Umgebungen35. Wenn die Zellen in technisch hergestellten 3D-Hydrogelen gezüchtet werden, lagern sie frühzeitig eine inhärente EZM ab, die Adhäsionsstellen bietet und aktiv umgestaltet werden kann28,36. Um ein vereinfachtes 3D-Modell für Screening-Anwendungen zu erstellen, wurden gefäßbildende Zellen auf die Oberfläche von künstlich hergestellten Hydrogelen gesät und in der Lage sein, Gefäßnetzwerke ohne Perfusion aufzubauen. Die bildgebenden Auswertungen wurden an 2D-Projektionen der Endothelzellen durchgeführt, die zu vaskulären Strukturen beitragen. Allerdings zeigten nur konfokale Aufnahmen das weniger ausgeprägte Einwachsen der 3D-Gefäßnetzwerke in den BMP-2-stimulierten Proben im Vergleich zu den FGF-2-stimulierten Proben. Dies deutet darauf hin, dass die Länge der gebildeten Gefäßstrukturen unterschätzt wurde, während ihre Konnektivität überschätzt wurde. Darüber hinaus wurden die Wechselwirkungen zwischen perivaskulären und endothelialen Zellen und der vaskulären Lumenbildung nicht untersucht. Diese Aspekte, insbesondere im Hinblick auf das Ansprechen auf die medikamentöse Behandlung, müssen weiter beachtet werden. Schließlich wären verfeinerte Protokolle wünschenswert, um zunächst umfangreiche 3D-Gefäßnetzwerke zu etablieren und erst dann deren osteogene Differenzierung zu induzieren, um physiologischere Knochen- und Knochenmarkmodelle zu generieren.

Insgesamt ist das hier vorgestellte Modell sehr vielseitig und kann leicht auf bestimmte Anwendungen zugeschnitten werden. Zum Beispiel könnten mesenchymale und endotheliale Zellen aus unterschiedlichen Quellen verwendet werden. Es ist bekannt, dass Fettgewebs-MSCs und Nabelschnur-MSCs im Vergleich zu BM-MSCs unterschiedliche angiogene Faktoren exprimieren und leicht als alternative Stromakomponente substituiert werden können37. Anstelle von HUVECs könnten auch Endothelzellen verwendet werden, die aus bereits definierten Knochenmarknischen isoliert wurden. Man könnte die Co-Kultur auch mit patientenbezogenen, passenden mesenchymalen und endothelialen Knochenmarkszellen für Anwendungen in der personalisierten Medizin etablieren, wie es kürzlich für vaskularisierte Muskel-Co-Kulturen vorgeschlagen wurde38. Darüber hinaus ermöglicht das Design der Hydrogelplatte die longitudinale Überwachung der Kultur sowohl mit Hellfeld- als auch mit Fluoreszenzmikroskopie und bietet dem Anwender somit die Möglichkeit, die Kulturzeit je nach Anwendung zu verkürzen oder zu verlängern. Alternativ könnten die Zelldichten, die für die Aussaat verwendet werden, entsprechend angepasst werden, um die Bildung des Zellnetzwerks zu beschleunigen oder zu verzögern, wenn kürzere oder längere Beobachtungszeiten als die in diesem Protokoll vorgesehenen erforderlich sind. In jedem Fall ist Vorsicht geboten, um ein Überwachsen der Zellen zu schichtartigen Strukturen zu vermeiden, was zur Kontraktion des Hydrogels und schließlich zur Zellablösung führen kann.

Schließlich kann mit diesem Modell eine breite Palette von Assays durchgeführt werden. Zusätzlich zur Immunfluoreszenz und Mikroskopie, die in lebenden oder festen Kulturen durchgeführt wird, können die 3D-Kulturen enzymatisch verdaut werden, und die Zellen können entnommen und jeder Art von biochemischem Assay unterzogen werden. Hier demonstrieren wir die Bestimmung der ALP-Aktivität und der Quantifizierung des DNA-Gehalts in Zelllysaten mit Hilfe von kolorimetrischen/fluorometrischen Assays, aber das System ist mit vielen anderen Techniken kompatibel, einschließlich PCR, RNAseq und Proteomik. Wenn die Empfindlichkeit des gewünschten Assays nicht sehr hoch ist, kann man Proben aus mehr als einem Well zusammenfassen, um die für den Assay verfügbare Probenmenge zu erhöhen. Wenn die gewünschte Anwendung eine schnellere Gelauflösung erfordert, könnte ein orbitales Schütteln der Platte in Kombination mit kleineren Volumina der Verdauungslösung angewendet werden, um die Wirbelbildung in den Vertiefungen zu gewährleisten, vorausgesetzt, dass alle Vertiefungen auf der Platte auf diese Weise verwendet werden (lebende Kulturen reagieren empfindlich auf eine solch raue Handhabung). Zusammenfassend stellen wir hier ein Protokoll vor, das, wenn es wie beschrieben verwendet wird, die Generierung eines in vitro Modells garantiert, das die wichtigsten Aspekte osteogener vaskulärer Nischen rekapituliert, aber auch vielseitig genug ist, um für maßgeschneiderte Anwendungen modifiziert zu werden.

Offenlegungen

Die Ectica Technologies AG ist der Hersteller der 3DProSeed Hydrogel-Well-Platte und hat kommerzielle Beteiligungen. Benjamin R. Simona und Martin Ehrbar sind Aktionäre der Ectica Technologies AG.

Danksagungen

Die Autoren danken Riccardo Urbanet für die technische Unterstützung bei den Liquid-Handling-Geräten und Rodi Odabasi für die Unterstützung bei der Epifluoreszenzmikroskopie. Finanziert wurde diese Arbeit vom Schweizerischen Nationalfonds (Förderkennzeichen 310030E_202429 und 205321_204318) und der Ectica Technologies AG.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-072
2 mL microtubesEppendorf30120094
2-Amino-2-methyl-1-propanolSigmaA9199
3DProSeed hydrogel well plateEctica TechnologiesECT.PS1.001.096
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrateSigma71768
Alizarin Red SSigmaA5533
Anti-Collagen IV antibodyAbcamab6311
Anti-Laminin 1+2 antibodyAbcamab7463
Automated plate washerAgilent BiotekELχ50
Automated washer/dispenserAgilent BiotekMULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette
BevacizumabEvidenticID PS-E07-2019-00119 A009
BMP-2Peprotech120-02C
BSAAppliChemA1391
CentrifugeEppendorf5415 RTo centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis
Confocal laser scanning microscopeLeicaStellaris 5
Conical 50 mL centrifuge tubesTPP91050
DAPISigmaD9542
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) AntibodyBiolegend406406
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) AntibodyBiolegend405312
EGM-2LonzaCC-3162
Epifluorescence microscopeLeicaDMI6000B
FBSGibco10500-064
FGF-2Peprotech100-18B
Fibronectin (IST-9)Santa Cruzsc-59826
GFP-HUVECsPELOBiotechPB-CAP-0001GFP
hBM-MSCs--Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359
Inverted microscopeZeiss200M
Magnesium chlorideSigmaM8266
MDA-MB-231 breast cancer cell line-Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
MEMαGibco22571-038
Multimode imaging readerAgilent BiotekCytation 1For automated imaging
Multimode imaging reader - fluorescence and absorbanceAgilent BiotekCytation 5For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis
ParaformaldehydeArtechemisUS 040
PBSGibco10010-015
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Phalloidin-rhodamineInvitrogenR415
Picro-Sirius Red SolutionAbcamab246832
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kitThermoFisher ScientificP7589
Recombinant Anti-Collagen I antibodyAbcamab260043
SIGMAFAST BCIP/NBTSigmaB5655-25TAB
Sodium hydroxideSigma1064981000
Sodium phosphate dibasic, anhydrousSigmaS-0876
Sodium phosphate monobasic, monohydrateMerck1.06346
Triton X-100SigmaT8787
Tween20AppliChemA4974
U2OS osteosarcoma cell line-Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich 
α-trehalose dihydrateSigma90208

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