In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati Rappresentativi
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un modello in vitro della nicchia vascolare del midollo osseo viene stabilito seminando cellule mesenchimali ed endoteliali su idrogel PEG 3D prefabbricati. Le reti endoteliali, i componenti della ECM e l'attività ALP delle nicchie variano a seconda del fattore di crescita utilizzato. La piattaforma può essere utilizzata per modelli avanzati di cancro.

Abstract

L'osso e il midollo osseo sono organi altamente vascolarizzati e strutturalmente complessi e sono siti per la formazione di cancro e metastasi. I modelli in vitro che ricapitolano le funzioni specifiche dell'osso e del midollo osseo, compresa la vascolarizzazione, che sono compatibili con lo screening farmacologico sono altamente desiderabili. Tali modelli possono colmare il divario tra modelli in vitro bidimensionali (2D) semplicistici e strutturalmente irrilevanti e i modelli in vivo più costosi ed eticamente impegnativi. Questo articolo descrive un saggio di co-coltura tridimensionale (3D) controllabile basato su matrici poli(glicole etilenico) ingegnerizzate (PEG) per la generazione di nicchie vascolarizzate, osteogeniche del midollo osseo. Il design della matrice PEG consente lo sviluppo di colture cellulari 3D attraverso una semplice fase di semina cellulare che non richiede incapsulamento, consentendo così lo sviluppo di complessi sistemi di co-coltura. Inoltre, le matrici sono trasparenti e prefabbricate su lastre di imaging a 96 pozzetti con fondo di vetro, rendendo il sistema adatto alla microscopia. Per il test qui descritto, le cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano (hBM-MSCs) vengono prima coltivate fino a formare una rete cellulare 3D sufficientemente sviluppata. Successivamente, vengono aggiunte cellule endoteliali della vena ombelicale umana che esprimono GFP (HUVEC). Lo sviluppo della coltura è seguito dalla microscopia a campo chiaro e a fluorescenza. La presenza della rete hBM-MSC favorisce la formazione di strutture vascolari che altrimenti non si formerebbero e che rimangono stabili per almeno 7 giorni. L'estensione della formazione di reti vascolari può essere facilmente quantificata. Questo modello può essere sintonizzato verso una nicchia osteogenica del midollo osseo integrando il terreno di coltura con la proteina morfogenetica ossea 2 (BMP-2), che promuove la differenziazione osteogenica delle hBM-MSCs, come valutato dall'aumento dell'attività della fosfatasi alcalina (ALP) al giorno 4 e al giorno 7 della co-coltura. Questo modello cellulare può essere utilizzato come piattaforma per la coltura di varie cellule tumorali e studiare come interagiscono con nicchie vascolari specifiche dell'osso e del midollo osseo. Inoltre, è adatto per l'automazione e le analisi ad alto contenuto, il che significa che consentirebbe lo screening dei farmaci antitumorali in condizioni di coltura altamente riproducibili.

Introduzione

L'osso e il midollo osseo sono organi strutturalmente e funzionalmente complessi centrali per la salute umana. Ciò si riflette nell'esistenza di nicchie distinte che regolano l'ematopoiesi e il mantenimento osseo1. È ormai ampiamente accettato che nel midollo osseo sano, il mantenimento e l'espansione delle cellule staminali ematopoietiche e scheletriche, così come la loro progenie, sono controllati da nicchie distinte. Queste nicchie comprendono vari tipi di cellule, tra cui cellule osteolignaggio, cellule staminali mesenchimali, cellule endoteliali e perivascolari, cellule neuronali e gliali, adipociti, osteoclasti, macrofagi e neutrofili2. Non sorprende che queste nicchie per lo più associate alla vascolarizzazione siano anche coinvolte nello sviluppo di vari tipi di leucemia3 e siano il sito di metastasi per diversi tumori4. A causa dei suoi ruoli specifici nella formazione ossea, nel rimodellamento e nella manutenzione ossea (midollo), la vascolarizzazione associata all'osso ha strutture specializzate distinte diverse dalla vascolarizzazione che si trova altrove nel corpo 5,6,7. Pertanto, i farmaci anti-angiogenici o modulanti la vascolarizzazione applicati sistemicamente possono avere effetti diversi all'interno di questi ambienti specializzati8. Pertanto, i modelli per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nel mantenimento delle proprietà fisiologiche dell'osso e del midollo osseo, la rigenerazione ossea e del midollo osseo e le risposte ai trattamenti terapeutici sono altamente desiderabili.

Le classiche colture tissutali bidimensionali (2D) e le indagini in vivo che utilizzano modelli animali hanno fornito informazioni preziose sui ruoli delle diverse cellule e attori molecolari coinvolti nello sviluppo dell'osso e del midollo osseo 9,10. I modelli che consentono esperimenti ad alto rendimento con cellule umane rilevanti potrebbero migliorare la nostra comprensione di come modulare i parametri selezionati in questi sistemi altamente complessi.

Negli ultimi dieci anni, i principi derivati dall'ingegneria tissutale sono stati impiegati per generare modelli di tessuto 3D11,12. Questi si sono basati principalmente sull'incapsulamento di cellule rilevanti per i tessuti in biomateriali per stabilire mono- o co-colture 3D13. Tra i biomateriali più utilizzati ci sono la fibrina 14, il collagene 15 e Matrigel16,17, tutti altamente biocompatibili e che forniscono condizioni appropriate per la crescita di molti tipi di cellule. Questi biomateriali hanno la capacità di generare modelli in vitro che ricapitolano aspetti chiave delle diverse nicchie vascolari trovate in vivo18. Inoltre, l'uso di dispositivi microfluidici per generare modelli ossei e midollari vascolari perfusi ha contribuito alla generazione di modelli in vitro di maggiore complessità 19,20,21,22.

La difficoltà nel controllare la composizione e ingegnerizzare le proprietà dei biomateriali presenti in natura ha ispirato lo sviluppo di analoghi sintetici che possono essere progettati razionalmente con proprietà fisiche, chimiche e biologiche prevedibili23,24. Abbiamo sviluppato idrogel completamente sintetici a base di poli(glicole etilenico) (PEG) reticolato con peptidi RGD e siti di scissione della metalloproteasi della matrice (MMP) per facilitare l'attaccamento e il rimodellamento delle cellule25,26. Il design modulare di questi biomateriali è stato utilizzato con successo per ottimizzare le condizioni per la formazione di modelli 3D vascolarizzati di ossa e midollo osseo27,28.

Per testare un numero maggiore di diverse condizioni di coltura e nuove terapie, sono necessari modelli con una maggiore capacità di throughput. Abbiamo recentemente dimostrato che la reticolazione FXIII del nostro idrogel PEG può essere controllata attraverso un processo elettrochimico tale da formare un gradiente di rigidità idrogel in profondità29. Quando le cellule vengono aggiunte sopra tali idrogel, migrano verso l'interno e gradualmente si sviluppano in reti cellulari 3D altamente interconnesse30. L'eliminazione della necessità di incapsulare le cellule nell'idrogel, che di solito è presente con altri scaffold 3D, non solo semplifica la progettazione sperimentale, ma consente anche l'aggiunta sequenziale di diversi tipi di cellule in diversi punti temporali per generare complessi sistemi di co-coltura. Questi idrogel sono disponibili prefabbricati su lastre di imaging a 96 pozzetti con fondo di vetro, rendendo così la creazione di colture 3D realizzabili con protocolli di semina cellulare manuali e automatizzati. La trasparenza ottica degli idrogel PEG rende la piattaforma compatibile con la microscopia.

Qui, presentiamo un metodo semplice per la generazione e la caratterizzazione di nicchie osteogeniche vascolarizzate, all'interno di questa piattaforma plug-and-play sintetica pronta all'uso. Mostriamo che lo sviluppo di reti vascolari può essere stimolato con un fattore di crescita comunemente usato per indurre l'osteogenesi in vitro, la proteina morfogenetica ossea-2 (BMP-2), mentre la differenziazione osteogenica può essere prevenuta con l'integrazione del fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF-2)27,31. Le reti formate sono diverse rispetto alle reti stimolate da FGF-2 in termini di aspetto generale, nonché di distribuzione cellulare ed ECM. Inoltre, abbiamo monitorato l'induzione osteogenica utilizzando la fosfatasi alcalina come marcatore. Dimostriamo l'aumento dell'espressione di questo marcatore nel tempo e confrontiamo l'espressione con quella nelle reti stimolate FGF-2 utilizzando metodi qualitativi e quantitativi. Infine, dimostriamo l'idoneità delle nicchie generate di questo modello per due potenziali applicazioni. In primo luogo, abbiamo eseguito un test di sensibilità ai farmaci proof-of-concept aggiungendo bevacizumab a nicchie preformate e monitorando il degrado delle reti vascolari in sua presenza. In secondo luogo, abbiamo aggiunto MDA-MB-231 cancro al seno e cellule di osteosarcoma U2OS a nicchie osteogeniche preformate, dimostrando che le nicchie possono essere utilizzate per studiare le interazioni tra le cellule tumorali e il loro ambiente.

Protocollo

Nella Figura 1 sono riepilogate le seguenti sezioni del protocollo.

1. Stabilire la monocoltura stromale 3D

  1. Preparare la sospensione cellulare hBM-MSC.
    1. Far crescere hBM-MSC a un livello di confluenza del 70%-90% in MEMα integrato con 10% FBS, 1% penicillina-streptomicina e 5 ng/mL FGF-2 in un incubatore a 37 °C e 5% CO2 in atmosfera umidificata. Le celle possono essere utilizzate fino al passaggio 6.
    2. Lavare le cellule con PBS e staccarle con tripsina-EDTA allo 0,05% per 3-5 minuti a 37 °C. Interrompere il processo di distacco mediante lavaggio con mezzo basale (MEMα integrato con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina). Raccogliere le celle sospese in una provetta conica da centrifuga da 50 ml.
    3. Contare le cellule utilizzando un ematocitometro o un contatore automatico delle cellule e determinare il numero totale di cellule nella sospensione.
    4. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 200 x g per 5 min. Rimuovere con attenzione il surnatante.
    5. Risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno basale per ottenere una concentrazione di 1 x 107 cellule/ml di soluzione madre.
    6. Preparare provette coniche da centrifuga da 50 mL contenenti il volume richiesto di mezzo basale integrato con i rispettivi fattori di crescita (FGF-2 e BMP-2 a concentrazioni definite, ad esempio 0 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL o 200 ng/mL). Per pozzetto sono necessari 200 μL. Se la semina delle celle deve essere eseguita utilizzando un manipolatore automatico di liquidi, considerare anche il volume morto dello strumento. Per la semina manuale delle celle, è sufficiente un eccesso di volume del 10%.
    7. Aggiungere le hBM-MSC dalla soluzione madre ad una diluizione di 1:66,67 per ottenere una concentrazione di 1,5 x 105 cellule/ml.
  2. Preparare il piatto per la semina.
    1. Rimuovere la pellicola adesiva in polipropilene che copre la piastra di idrogel a 96 pozzetti.
    2. Aspirare con attenzione il tampone di stoccaggio che copre gli idrogel. Per questa operazione, utilizzare una rondella a micropiastre; tuttavia, è possibile la movimentazione manuale.
      1. Quando si utilizza un aspiratore manuale o una pipetta multicanale, posizionare la punta contro la parete del pozzetto e spostarsi lentamente verso il bordo del pozzetto interno mentre si aspira il tampone. Ciò eviterà di danneggiare la superficie dell'idrogel.
      2. Quando si utilizza una rondella a piastre automatica, impostare gli ugelli di aspirazione ad almeno 3,8 mm dal portapiastre (questo corrisponde a 0,8 mm dall'anello interno della piastra di idrogel) e verso il bordo del pozzetto. Fare riferimento al manuale del produttore per istruzioni più dettagliate e per ottenere i disegni delle lastre della piastra di idrogel a 96 pozzetti.
  3. Aggiungere 200 μL/pozzetto della sospensione cellulare preparata al punto 1.1.7 dopo aver miscelato accuratamente per assicurarsi che le cellule siano distribuite in modo omogeneo. Durante la semina, per evitare la sedimentazione irregolare delle cellule in una regione del substrato, non inclinare la piastra. Per la semina manuale, mescolare periodicamente la sospensione cellulare (dopo aver seminato tre pozzetti) per mantenere la miscela omogenea. Per la semina automatica, mescolare con un pipettuccio sierologico immediatamente prima dell'erogazione per erogare volumi contenenti un numero uguale di cellule.
  4. Mantenere le colture a 37 °C e 5% di CO2 in atmosfera umidificata.
  5. Monitorare lo sviluppo delle colture mediante microscopia a campo chiaro con un obiettivo 5x come desiderato. Acquisire immagini di riferimento circa 30 minuti dopo la semina per valutare il numero di celle aggiunte.

2. Stabilire la co-coltura 3D di cellule stromale-endoteliali

  1. Preparare la sospensione cellulare GFP-HUVEC.
    1. Preparare i palloni per la coltura HUVEC rivestendoli con una soluzione costituita da 150 μg/ml di collagene a coda di ratto I in acido acetico 0,02 M per 30 minuti a 37 °C. Risciacquare una volta con PBS prima dell'uso.
    2. Far crescere i GFP-HUVEC a un livello di confluenza dell'80%-100% in EGM-2 integrato con il 10% di FBS in un incubatore a 37 °C e il 5% di CO2 in atmosfera umidificata. Le celle possono essere utilizzate fino al passaggio 7.
    3. Lavare le cellule con PBS e staccarle con tripsina-EDTA allo 0,05% per 2-3 minuti a 37 °C. Interrompere il processo di distacco mediante lavaggio con mezzo basale (MEMα integrato con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina). Raccogliere le celle sospese in una provetta conica da centrifuga da 50 ml.
    4. Contare le cellule utilizzando un ematocitometro o un contatore cellulare automatizzato e determinare il numero totale di cellule presenti nella sospensione.
    5. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 200 x g per 5 min. Rimuovere con attenzione il surnatante.
    6. Risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno basale per ottenere una concentrazione di 1 x 107 cellule/ml di soluzione madre.
    7. Preparare provette coniche da centrifuga da 50 mL contenenti il volume richiesto di mezzo basale integrato con i rispettivi fattori di crescita (FGF-2 e BMP-2 a concentrazioni definite, ad esempio 0 ng/ml, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL o 200 ng/mL) come descritto per le hBM-MSC al punto 1.1.6.
    8. Aggiungere i GFP-HUVEC dalla soluzione madre ad una diluizione di 1:66,67 per ottenere una concentrazione di 1,5 x 105 cellule/ml, come descritto per le hBM-MSC al punto 1.1.7.
  2. Aspirare il mezzo dalla piastra contenente la monocoltura stromale, come descritto per la rimozione del tampone al punto 1.2.2.
  3. Aggiungere 200 μL/pozzetto della sospensione cellulare GFP-HUVEC preparata al punto 2.1.8 come descritto per l'aggiunta di hBM-MSC al punto 1.3.
  4. Incubare a 37 °C e 5% di CO2 in atmosfera umidificata. Cambia il mezzo ogni 3-4 giorni.
  5. Monitorare lo sviluppo della coltura mediante microscopia a campo chiaro e a fluorescenza utilizzando un obiettivo 5x come desiderato. Mantenere le colture fino al giorno 4 o al giorno 7 della co-coltura per caratterizzazioni precoci o intermedie, rispettivamente, o come desiderato.

3. Procedura di caratterizzazione 1: Quantificazione della formazione di reti cellulari endoteliali

  1. Nei punti temporali desiderati, acquisire il segnale GFP dai GFP-HUVEC con microscopia a fluorescenza utilizzando impostazioni adatte alla quantificazione (ad esempio, messa a fuoco migliore, contrasto elevato e basso ingrandimento [ad esempio, 5x] per campi visivi più ampi).
  2. Pre-elaborare equamente tutte le immagini acquisite nello stesso giorno (ad esempio, utilizzando Fiji32) per migliorare ulteriormente il contrasto. Si noti che il segnale GFP può diventare più debole con il tempo di coltura; Pertanto, le immagini acquisite in giorni diversi potrebbero richiedere un'elaborazione diversa.
    1. Se utilizzate Fiji o ImageJ, aprite tutte le immagini del canale GFP dello stesso punto temporale e aprite il menu Luminosità e contrasto . Selezionare un'immagine che rappresenti una condizione intermedia (non il segnale più debole e non il segnale più luminoso) e regolare automaticamente il contrasto selezionando Auto. Selezionare Imposta e selezionare Propaga a tutte le altre immagini aperte.
    2. Valuta visivamente se l'intervallo selezionato automaticamente si adatta a tutte le immagini del punto temporale corrente e riadattalo e propaga manualmente a tutte le immagini in base alle esigenze.
    3. Salvare le immagini modificate come file TIF e ripetere i passaggi 3.2.1 e 3.2.2 per gli altri punti temporali acquisiti.
  3. Applicare un filtro di sfocatura mediana (ad esempio, raggio 3 per immagini 2048x2048) a tutte le immagini per evitare il riconoscimento degli artefatti a valle e, quindi, facilitare l'identificazione accurata della rete. Riducete le dimensioni mediante binning (2x2) e salvate tutte le immagini pre-elaborate come file TIF a colori RGB in scala di grigi in una cartella per la quantificazione. Questi passaggi possono essere eseguiti manualmente o in modalità batch utilizzando macro che gli autori condivideranno su richiesta.
  4. Analizzare tutte le immagini nella cartella creata nei passaggi 3.1-3.3 utilizzando la modalità Batch Process in Angiogenesis Analyzer for ImageJ33. Si noti che, a seconda delle dimensioni delle immagini e della memoria di lavoro disponibile, potrebbero essere necessari alcuni minuti per immagine.
  5. Convalidare i risultati della quantificazione esaminando le sovrapposizioni delle strutture riconosciute e le immagini originali. Se l'algoritmo riconosce strutture artificiali, dove solo poche o nessuna cella può essere vista nell'immagine originale, regolare i parametri di pre-elaborazione e rianalizzare le immagini originali o escludere tali aree problematiche e / o replicare le immagini dall'analisi.
  6. Normalizzare i valori ottenuti su un'area di 1 mm 2 moltiplicando i valori di ciascun campione per il rapporto tra l'area analizzata e 1 mm2. Questo passaggio è di particolare importanza se vengono utilizzate immagini di dimensioni diverse.
  7. Estrarre vari parametri di rete, come la lunghezza totale della rete, il numero di giunzioni, il numero di segmenti, il numero di segmenti isolati, l'intervallo di ramificazione e la dimensione media della mesh, dall'analisi e utilizzarli per caratterizzare la rete endoteliale in diversi punti temporali e in diverse condizioni di coltura.

4. Procedura di caratterizzazione 2: Valutazione della deposizione di ECM

  1. Nei punti finali desiderati, valutare la deposizione di ECM utilizzando l'immunofluorescenza. Aggiungere anticorpi primari contro varie molecole di ECM in 100 μL del terreno di coltura durante le ultime 6 ore di coltura o dopo la fissazione, come descritto di seguito.
    1. Lavare le colture una volta con 200 μL / pozzetto di PBS per 5 minuti a RT e fissarle con 100 μL / pozzetto di paraformaldeide al 4% sotto una cappa di fumi chimici per 30 minuti a RT. Si noti che si consiglia di fissare tutti i pozzetti di una piastra allo stesso tempo, poiché le colture circostanti potrebbero essere danneggiate durante questa fase. Lavare le colture fisse con 200 μL/pozzetto di PBS a RT tre volte per 5 minuti ogni volta e conservare a 4 °C in 200 μL/pozzetto di PBS, oppure procedere immediatamente alla fase successiva.
    2. Prima di incubare con anticorpi primari contro le molecole di ECM dopo la fissazione, incubare le colture fisse con 200 μL/pozzetto di BSA all'1% in PBS come soluzione bloccante per 30 minuti a RT.
      1. Aspirare la soluzione bloccante e incubare con 100 μL/pozzetto della soluzione anticorpale primaria in BSA all'1% in PBS per una notte a 4 °C. Lavare con 200 μL/pozzetto di PBS tre volte per 5 minuti, almeno 3 ore e 5 minuti, rispettivamente, a RT.
        NOTA: La lunga fase di lavaggio è necessaria per la completa diffusione dell'anticorpo non legato fuori dall'idrogel.
    3. Per facilitare la penetrazione della soluzione di colorazione secondaria, comprese le controcolorazioni intracellulari, permeabilizzare le colture utilizzando lo 0,3% di Triton X-100 e l'1% di BSA in PBS per 30-90 minuti a RT, a seconda della densità cellulare delle colture.
      NOTA: Per la colorazione basata su anticorpi di molecole intracellulari, questa fase deve essere eseguita prima dell'incubazione con l'anticorpo primario descritto al punto 4.1.2.
    4. Preparare soluzioni di colorazione secondaria contenenti i rispettivi anticorpi secondari e controcoloranti come desiderato (ad esempio, una colorazione nucleare come DAPI e una colorazione citoscheletrica come la falloidina-rodamina).
      1. Preparare un tampone colorante costituito da 0,1% Triton X-100, 1% BSA in PBS e controcoloranti (ad esempio, 1 μg/mL DAPI e 1:4.000 falloidina-rodamina) e aggiungere i rispettivi anticorpi secondari alle diluizioni raccomandate.
      2. Aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione di colorazione secondaria e incubare per una notte a 4 °C. Analogamente alla procedura dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, lavare con 200 μL/pozzetto di PBS tre volte per 5 minuti, almeno 3 ore e 5 minuti, rispettivamente, a RT.
    5. Per la risoluzione 3D delle strutture, acquisire pile confocali a partire dal fondo di vetro con uno z-step di 2,5 μm raggiungendo un'altezza finale di 500 μm, utilizzare un obiettivo 10x e uno zoom digitale 0,75x. Per generare una ricostruzione 3D del segnale GFP e F-actina nelle Figi, sospendi ciascun canale separatamente prima di creare un composito e generare la ricostruzione utilizzando Fiji 3D Viewer.
    6. Per la visualizzazione dell'ECM depositato dalle immunocolorazioni, acquisire pile confocali di un'altezza di 100 μm con uno z-step di 5 μm, un obiettivo 10x e uno zoom digitale 1,5x. Genera proiezioni di intensità massima e regola la luminosità e il contrasto per ciascun canale separatamente nelle Figi prima di creare un composito.
  2. Eseguire colorazioni colorate dirette dell'ambiente extracellulare.
    1. Aggiungere 200 μL/pozzetto di soluzione colorante Picrosirius Red ai pozzetti fissati con paraformaldeide e incubare per 1 ora a RT.
    2. Quindi, lavare i pozzetti macchiati cinque volte con acqua distillata, quindi lavare due volte al giorno o ogni secondo giorno per 3-4 giorni mentre si monitora la pulizia del colore del campione. Mantenere le piastre a 4 °C durante le lunghe fasi di lavaggio (cioè qualsiasi cosa superi le 6 ore).
    3. Acquisire immagini dei campioni colorati utilizzando un microscopio a campo chiaro dotato di una fotocamera a colori e mantenere un bilanciamento del bianco uguale in tutte le condizioni. Per acquisire una panoramica dei campioni, utilizzare un basso ingrandimento (ad esempio, 2,5x) per scansionare l'intero pozzetto. Se il microscopio non viene fornito con un software che supporta la cucitura automatica, farlo manualmente (ad esempio, utilizzando Pairwise Stitching in Fiji34).
      NOTA: I pozzetti precedentemente utilizzati per l'immunofluorescenza possono essere utilizzati per questo, a condizione che l'acquisizione dell'immagine di fluorescenza sia completata.
    4. Seguire gli stessi passaggi descritti per la colorazione Picrosirius Red nei passaggi 4.2.1-4.2.3 per eseguire la colorazione, il lavaggio e l'imaging di Alizarin Red.

5. Procedura di caratterizzazione 3: Valutazione del differenziamento osteogenico mediante monitoraggio dell'attività ALP

  1. In diversi punti temporali finali della coltura (ad esempio, giorno 4 e giorno 7 della co-coltura), valutare quantitativamente l'attività ALP utilizzando la colorazione 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) / nitro blu tetrazolio (NBT).
    1. Lavare le colture una volta con 200 μL/pozzetto di PBS prima di incubare con la soluzione di substrato BCIP/NBT, che deve essere preparata seguendo le istruzioni del produttore. Incubare a 37 °C monitorando periodicamente lo sviluppo del colore. Una volta che il colore inizia a svilupparsi in condizioni non osteogeniche, lavare immediatamente una volta con 200 μL/pozzetto di PBS prima di fissare con paraformaldeide al 4%, come descritto al punto 4.1.1.
    2. Acquisire immagini a colori dei campioni colorati, come descritto al punto 4.2.3 per la colorazione di Picrosirius Red.
  2. In diversi punti temporali finali della coltura (ad esempio, giorno 4 e giorno 7 della co-coltura), quantificare l'attività ALP nei lisati cellulari.
    1. Lavare le colture tre volte con 200 μL/pozzetto di PBS prima di incubare con 200 μL/pozzetto di tripsina-EDTA allo 0,25% a 37 °C. Ogni 10 minuti, agitare le colture con un vigoroso pipettaggio su e giù per facilitare la digestione e monitorare la morfologia della coltura con un microscopio per colture cellulari standard.
    2. Una volta ottenuta una sospensione liquida unicellulare senza strutture cellulari allungate nei pozzetti (tipicamente dopo 20-30 minuti), trasferire i campioni in provette da 2 ml, aggiungere 200 μL di terreno basale MSC per inibire la tripsina e centrifugare a 500 x g per 5 minuti per pellettare le cellule recuperate. Decantare il surnatante e congelare i pellet a −80 °C, oppure procedere direttamente al punto 5.2.3.
    3. Scongelare i pellet cellulari ottenuti nella fase 5.2.2 e incubare con 500 μL di tampone di lisi costituito da 0,56 M 2-ammino-2-metil-1-propanolo, 0,2% Triton X-100, pH 10, per 30 minuti su ghiaccio. Quindi, centrifugare a 16.100 x g per 10 minuti a 4 °C e mantenere i campioni su ghiaccio. Dopo le misurazioni descritte al punto 5.2.7, congelare i campioni a -20 °C o -80 °C o proseguire direttamente con la quantificazione del DNA, come descritto nella fase 5.2.8.
      NOTA: Il tampone di lisi può essere preparato in anticipo, filtrato sterile e conservato a 4 °C.
    4. Preparare il reagente ALP costituito da 20 mM di 4-nitrofenilfosfato sale disodico esaidrato e 4 mM di MgCl2 in tampone di lisi.
      NOTA: È meglio preparare questa soluzione fresca il giorno della quantificazione.
    5. Senza disturbare i detriti pellettati, erogare 50 μL del surnatante lisato cellulare preparato al punto 5.2.3 nei pozzetti di una piastra standard trasparente a 96 pozzetti per colture tissutali in duplicati. Aggiungere il buffer di lisi a due pozzetti come controlli vuoti.
    6. Con una pipetta multicanale, aggiungere 50 μL/pozzetto di reagente ALP ai pozzetti riempiti al punto 5.2.5. Agitare brevemente la piastra e incubare a 37 °C per 10 minuti al riparo dalla luce. I pozzi con maggiore attività ALP appariranno gialli. Interrompere la reazione aggiungendo 100 μL/pozzetto di 1 M NaOH utilizzando una pipetta multicanale.
    7. Leggere la densità ottica a 410 nm utilizzando un lettore di piastre. Calcolare la media dei duplicati tecnici e sottrarre la media dei controlli vuoti.
    8. Eseguire la quantificazione del DNA per normalizzare l'attività ALP determinata nei passaggi precedenti rispetto al numero totale di cellule. Qui viene descritto un metodo basato su misurazioni di fluorescenza, ma qualsiasi altro metodo per la quantificazione del DNA nei lisati cellulari è compatibile con il test. Preparare i reagenti e gli standard del DNA necessari per la quantificazione del DNA utilizzando kit disponibili in commercio secondo le istruzioni dei produttori.
      NOTA: Si raccomanda di utilizzare il tampone di lisi per preparare gli standard del DNA.
    9. Se i campioni utilizzati per la quantificazione delle ALP descritte al punto 5.2.3 sono stati congelati, scongelarli, centrifugarli a 16.100 x g per 2 minuti a 4 °C e porli su ghiaccio. Senza disturbare i detriti pellettati, erogare 50 μL del surnatante di lisato cellulare nei pozzetti di una piastra nera a 96 pozzetti in duplicati. Congelare i campioni a -20 °C o -80 °C e, se necessario, ripetere le quantificazioni ALP e DNA. Aggiungi gli standard del DNA in duplicati.
    10. Con una pipetta multicanale, aggiungere 50 μL dell'agente colorante del DNA, incubare e leggere l'intensità della fluorescenza secondo le istruzioni del produttore. Utilizzando i valori della curva standard, determinare e applicare la conversione dei valori di intensità misurati nelle concentrazioni di DNA.
    11. Normalizzare i valori ALP ottenuti al punto 5.2.7 dividendoli per la rispettiva concentrazione di DNA di ciascun campione.

6. Applicazione 1: Esecuzione di saggi di sensibilità ai farmaci

  1. Quando le reti endoteliali sono completamente sviluppate (tipicamente al giorno 4 delle co-colture di cellule stromale-endoteliali), aggiungere composti anti-angiogenici, come bevacizumab, alle colture in terreno di coltura fresco e testare la loro attività nel tempo e in condizioni diverse (ad esempio, diverse concentrazioni di FGF-2 o BMP-2).
    1. Preparare terreni di coltura freschi contenenti gli stessi fattori di crescita utilizzati per le rispettive colture fino a quel momento.
      1. Preparare una soluzione di controllo costituita dal diluente del composto di interesse (ad esempio, per bevacizumab: 60 mg/ml di α-trealosio diidrato, 0,4 mg/ml di Tween20, 5,8 mg/ml di fosfato di sodio, monobasico e monoidrato e 1,2 mg/ml di sodio fosfato bibasico, anidro) e filtrarla sterile.
      2. Aggiungere il composto di interesse alla concentrazione desiderata (ad esempio, 10 μg/mL di bevacizumab) e un volume uguale della soluzione di controllo al terreno di coltura designato rispettivamente per le condizioni di prova e di controllo.
  2. Aspirare il terreno dalla coltura e aggiungere 200 μL/pozzetto del terreno appena preparato al punto 6.1.1. Incubare per un tempo appropriato per il composto da testare (ad esempio, per bevacizumab: 2 giorni). Monitorare lo sviluppo della coltura e caratterizzare le reti endoteliali come descritto nel paragrafo 3. Valutare l'efficacia del composto nell'inibire l'angiogenesi o nell'ablare le strutture preformate utilizzando le immagini GFP e i parametri quantitativi della rete estratti dall'analisi descritta nella fase 3.7.

7. Applicazione 2: Stabilire sistemi avanzati di co-coltura con vari tipi di cellule tumorali

  1. Al giorno 4 della co-coltura, quando le reti endoteliali sono per lo più stabilite, aggiungere altri tipi di cellule, come MDA-MB-231 o cellule tumorali U2OS, alle colture in terreno di coltura fresco.
    1. Etichettare le cellule tumorali utilizzando un colorante vivo compatibile con le cellule secondo le istruzioni del produttore per poterle distinguere dagli HUVEC marcati con GFP e dalle hBM-MSC non marcate nelle co-colture.
    2. Preparare una sospensione di cellule tumorali ad una concentrazione di 1,5 x 104 cellule/ml in terreno di coltura fresco contenente gli stessi fattori di crescita utilizzati per le rispettive colture fino a quel momento.
  2. Monitorare lo sviluppo della coltura e la localizzazione delle cellule tumorali come desiderato.
    NOTA: A seconda del tipo di cancro, dell'attività e dell'ambiente, potrebbero essere necessari alcuni giorni prima che raggiungano le strutture vascolari nelle co-colture di cellule stromale-endoteliali (ad esempio, 2 giorni per MDA-BM-231 e U2OS). Pertanto, l'imaging time-lapse per visualizzare le interazioni tumore-cellule vascolari deve essere programmato di conseguenza.

Risultati Rappresentativi

Le colture vascolari di nicchia sono state stabilite seminando sequenzialmente hBM-MSC e GFP-HUVEC su idrogel prefabbricati a base di PEG con un gradiente di rigidità all'interno di una piastra di imaging a 96 pozzetti (Figura 1). Le colture sono state monitorate longitudinalmente tramite microscopia a epifluorescenza dal vivo e ulteriormente caratterizzate in punti temporali selezionati. Il compartimento extracellulare è stato valutato tramite colorazioni dirette e colorazioni a base di anticorpi. L'attività ALP è stata quantificata dopo aver recuperato e lisato le cellule dalle nicchie generate. Inoltre, dimostriamo l'idoneità di questa piattaforma per saggi di sensibilità ai farmaci anti-angiogenici e come base per modelli di co-coltura del cancro.

Le co-colture di hBM-MSCs e HUVEC che esprimono GFP sono state stabilite seminando 3 x 104 cellule/pozzetto in assenza di fattori di crescita o in presenza di FGF-2 o BMP-2 a 50 ng/ml, come descritto nel protocollo. Fin dai primi tempi, le differenze tra le colture potevano essere osservate sia dalle immagini in campo chiaro che da quelle di fluorescenza che mostravano solo i GFP-HUVEC (Figura 2A). Osservando le stesse aree longitudinalmente, si potrebbero notare differenze nello sviluppo delle culture, come uno sviluppo più rapido in presenza di FGF-2. Generalmente, le colture apparivano meno sviluppate in assenza di qualsiasi fattore di crescita, con un minor numero di cellule di entrambi i tipi che si diffondevano e la presenza di aree acellulari. Al contrario, le immagini a campo chiaro hanno mostrato le colture più dense in presenza di BMP-2. Tuttavia, le reti vascolari si sono formate in entrambe le condizioni contenenti il fattore di crescita e le reti più estese e interconnesse sono state formate con FGF-2. Queste differenze osservate potrebbero anche essere quantificate utilizzando Angiogenesis Analyzer per ImageJ. In effetti, la lunghezza totale della rete era più alta in presenza di FGF-2 e più bassa in assenza di fattori di crescita (Figura 2B). Il numero di giunzioni che indicano i punti di diramazione nelle reti ha seguito la stessa tendenza della lunghezza totale (figura 2C). Al contrario, entrambe le condizioni contenenti fattori di crescita presentavano un numero significativamente inferiore di segmenti isolati, indicando una maggiore interconnettività, rispetto alla condizione senza alcun fattore di crescita (Figura 2D). Inoltre, l'imaging confocale 3D ha rivelato una maggiore penetrazione delle cellule endoteliali in termini di profondità nella condizione stimolata da FGF-2 (Figura 2E).

Le co-colture HBM-MSC/GFP-HUVEC sono state mantenute per 7 giorni in presenza di FGF-2 o BMP-2 prima di essere fissate e colorate per i componenti ECM. Le colorazioni immunocitochimiche seguite dalla microscopia a scansione laser confocale hanno mostrato notevoli differenze nella morfologia della coltura a seconda del tipo di integrazione del fattore di crescita (Figura 3A). Con FGF-2, la coltura è stata organizzata in strutture microvascolari condensate, che erano dense sia nelle cellule endoteliali che mesenchimali, mentre in presenza di BMP-2, le hBM-MSC si estendevano su un'area molto più ampia, come evidente dalle aree F-actina-positive e GFP-negative più estese. Le proteine ECM fibronectina e collagene I erano localizzate in modo simile, mentre la laminina e il collagene IV erano più concentrati intorno alle strutture endoteliali. Tuttavia, questa maggiore concentrazione intorno alle strutture endoteliali era molto più pronunciata in presenza di FGF-2 che in presenza di BMP-2. Oltre alle colorazioni a base di anticorpi, sono state eseguite colorazioni dirette per valutare lo stato fibrotico complessivo della ECM (colorazione Picrosirius Red; Figura 3B), nonché la deposizione di Ca sulla ECM (colorazione Alizarin Red; Figura 3C) delle nicchie formate. La colorazione Picrosirius Red era più forte e più estesa nelle nicchie coltivate con BMP-2, e la colorazione Alizarin Red seguiva la stessa tendenza.

Successivamente, le colture sono state caratterizzate in termini di potenziale osteogenico valutando l'attività ALP come marcatore osteogenico precoce. Il giorno 4 e il giorno 7 della co-coltura, le cellule sono state recuperate dalle nicchie digerendo gli idrogel con tripsina. Per quantificare l'attività ALP, le cellule recuperate sono state lisate ed è stato eseguito un test pNPP. I valori ottenuti sono stati normalizzati rispetto al DNA totale per ciascun campione per tenere conto delle potenziali differenze nel numero di cellule tra le condizioni. In effetti, è stato possibile osservare piccole differenze tra il contenuto di DNA delle condizioni e il minor numero di cellule è stato recuperato dalla condizione senza alcun fattore di crescita (non mostrato). L'attività ALP normalizzata, tuttavia, variava notevolmente tra le condizioni, con una tendenza all'aumento dell'attività con concentrazioni più elevate di BMP-2 e un plateau a 100 ng / mL (Figura 4A,B). I livelli di attività più bassi sono stati identificati per la condizione contenente 50 ng/mL FGF-2. Mentre tendenze simili potrebbero essere osservate per entrambi i punti temporali valutati, tutti i valori sono aumentati significativamente nel tempo nella cultura dal giorno 4 al giorno 7. Oltre al test quantitativo, l'attività ALP potrebbe essere visualizzata qualitativamente utilizzando la colorazione diretta del colore basata sulla conversione del substrato BCIP/NBT. Una colorazione viola più estesa e più intensa è stata osservata in presenza di BMP-2 rispetto a FGF-2 (Figura 4C).

Per dimostrare due potenziali applicazioni delle nicchie osteogeniche caratterizzate, sono stati eseguiti uno studio di sensibilità ai farmaci proof-of-concept e co-colture di cancro. Per il test di sensibilità al farmaco, bevacizumab o una soluzione di controllo costituita dal diluente della formulazione di bevacizumab è stata aggiunta al terreno di coltura contenente BMP-2 fresco. Il giorno 4, quando si sono formate reti stabilite in presenza di 50 ng / mL BMP-2, è stata aggiunta la soluzione di controllo o il mezzo contenente bevacizumab durante il normale cambio del mezzo e le colture sono state monitorate utilizzando l'imaging a fluorescenza. L'aggiunta di 10 μg/mL di bevacizumab ha portato alla retrazione o all'ablazione della rete precedentemente formata, mentre la condizione di controllo presentava ancora reti estese 2 giorni dopo il cambiamento del mezzo (Figura 5A,B). Questi cambiamenti potrebbero anche essere quantificati monitorando la lunghezza totale delle reti utilizzando Angiogenesis Analyzer per ImageJ su immagini a fluorescenza acquisite giornalmente (Figura 5C). In alternativa, bevacizumab o qualsiasi altro composto potrebbe anche essere aggiunto dall'inizio della co-coltura per valutare la loro influenza sulla formazione delle reti. Nel caso di bevacizumab, questo ha completamente inibito la formazione di reti endoteliali (non mostrato).

Per la seconda applicazione, le cellule di carcinoma mammario MDA-MB-231 o osteosarcoma U2OS sono state aggiunte alle co-colture del giorno 4 ad una densità di 1,5 x 103 cellule / pozzetto in terreno di coltura fresco contenente 50 ng / mL BMP-2. Per distinguerle dalle HUVEC marcate con GFP e dalle hBM-MSC non marcate, le cellule tumorali sono state incubate con CellTrace FarRed poco prima della semina sulle nicchie osteogeniche. Le colture sono state monitorate mediante microscopia a fluorescenza; All'inizio, la maggior parte delle cellule tumorali si localizzava vicino alla superficie del substrato, ma dopo 2 giorni, potevano essere trovate in prossimità degli strati contenenti le co-colture vascolari. Pertanto, il giorno 2 è stato selezionato come punto di partenza per la microscopia time-lapse per mostrare la dinamica delle interazioni tra le cellule tumorali e le cellule all'interno della nicchia vascolare. È interessante notare che le cellule MDA-MB-231 potevano essere viste avvicinarsi e allontanarsi dalle strutture endoteliali e, quindi, stavano probabilmente sondando o rimodellando il loro ambiente (Figura 5D). Utilizzando CellTrace FarRed come etichetta per le cellule tumorali, GFP come etichetta per HUVEC e colorazione aggiuntiva per F-actina, tutti i tipi di cellule potrebbero essere distinti utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (Figura 5E).

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Figura 1: Un approccio semplice per la generazione affidabile di nicchie vascolarizzate, osteogeniche. Gli idrogel sintetici prefabbricati con un gradiente di rigidità profondo consentono la generazione di colture 3D tramite semina sequenziale delle cellule senza la necessità di incapsulamento diretto. Le hBM-MSC vengono pre-coltivate per 3 giorni prima che vengano aggiunte HUVEC che esprimono GFP. Le colture vengono monitorate acquisendo longitudinalmente segnali in campo chiaro e GFP. In determinati punti temporali, le nicchie vengono ulteriormente valutate per la loro deposizione ECM e lo stato osteogenico. L'attività della fosfatasi alcalina viene valutata tramite colorazione diretta del colore e recuperando le cellule dalle nicchie ed eseguendo un test pNPP sui lisati cellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Stimolazione di reti simil-vascolari con FGF-2 o BMP-2. (A) Le immagini in campo chiaro e fluorescenza (GFP) sono state acquisite il giorno 2, giorno 4 e giorno 6 della co-coltura di cellule cresciute in assenza di fattori di crescita o in presenza di FGF-2 o BMP-2, entrambi a 50 ng / ml. Barra della scala: 400 μm. (B-D) Parametri quantificati delle reti GFP-HUVEC ripresi il giorno 4 della co-coltura, analizzati utilizzando Angiogenesis Analyzer per ImageJ. I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando GraphPad Prism 9.5.1. Un normale test ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Dunnett è stato eseguito con n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Ricostruzioni tridimensionali generate da pile confocali (altezza totale: 547,5 μm; z-step: 2,5 μm) dei segnali GFP e F-actina per le condizioni stimolate FGF-2- (riga superiore) e BMP-2- (riga inferiore). Barra scala: 300 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Induzione della diffusione delocalizzata di hBM-MSC e della deposizione di ECM da parte di BMP-2. (A-C) Le co-colture di 7 giorni coltivate in presenza di FGF-2 o BMP-2 sono state sottoposte a (A) immunofluorescenza o (B,C) colorazione diretta del colore. (A) Le colture sono state colorate per F-actina e le proteine ECM fibronectina, laminina, collagene I e collagene IV. Le immagini raffigurano le proiezioni di massima intensità delle pile confocali (altezza totale: 100 μm; z-step: 5 μm). Barra della scala: 200 μm. (B,C) Le colture sono state colorate usando (B) Picrosirius Red e (C) Alizarin Red. La riga superiore raffigura panoramiche cucite e intere delle immagini acquisite con ingrandimento 2,5x (barra di scala: 1.000 μm), mentre la riga inferiore raffigura un campo visivo acquisito con ingrandimento 5x (barra di scala: 400 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Valutazione biochimica dell'attività ALP indotta da BMP-2 attraverso colorazione diretta del colore. (A,B) L'attività ALP è stata determinata nei lisati cellulari di colture coltivate in assenza di fattori di crescita o in presenza di BMP-2 a diverse concentrazioni o FGF-2 a 50 ng/ml per (A) 4 giorni o (B) 7 giorni di cocultura. L'attività ALP è mostrata normalizzata al contenuto di DNA di ciascun campione di lisato. I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando GraphPad Prism 9.5.1. Un normale ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Dunnett è stato eseguito con n = 5; P < 0,0001. (C) Colorazione diretta dell'attività ALP in nicchie coltivate in presenza di 50 ng/mL FGF-2 o BMP-2 per 7 giorni di co-coltura. Le immagini sul lato sinistro raffigurano panoramiche cucite a pozzetto intero di immagini acquisite con ingrandimento 2,5x (barra di scala: 1.000 μm), mentre le immagini sul lato destro raffigurano un campo visivo acquisito con ingrandimento 5x (barra di scala: 400 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Impiego di nicchie vascolarizzate osteogeniche in modelli oncologici avanzati. (A) I segnali GFP di colture coltivate in presenza di BMP-2 sono stati ripresi il giorno 4 della co-coltura prima che una soluzione di controllo (a sinistra) o bevacizumab a 10 μg / ml (a destra) fossero aggiunti per 2 giorni, dopo di che le colture sono state nuovamente visualizzate (giorno 6 della co-coltura). Barra della scala: 600 μm. (B) Immagini di ingrandimento più elevate delle colture trattate con bevacizumab sono mostrate in A. Barra scala: 250 μm. (C) La lunghezza totale delle reti endoteliali come mostrato in A è stata quantificata utilizzando Angiogenesis Analyzer per ImageJ da immagini acquisite quotidianamente; n ≥ 3. (D) Le cellule di cancro al seno MDA-MB-231 marcate con CellTrace FarRed sono state aggiunte alle co-colture di 4 giorni coltivate in presenza di BMP-2 e le immagini time-lapse sono state acquisite a partire da 2 giorni dopo l'aggiunta di cellule tumorali. Barra della scala: 100 μm. (E) Proiezioni di massima intensità di pile confocali (altezza totale: 70 μm; z-step: 2,4 μm) di cocolture triple generate come descritto in D e fissate e colorate per F-actina. A sinistra: nicchie con cellule di cancro al seno MDA-MB-231; a destra: nicchie con cellule di osteosarcoma U2OS. Barre di scala per immagini a sinistra: 200 μm; Barre di scala per le immagini a destra: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, descriviamo un protocollo per la creazione di un modello in vitro di nicchie ossee e midollari altamente vascolarizzate, in una matrice 3D basata su PEG completamente sintetica e controllabile, che ha una varietà di applicazioni nella ricerca sulla biologia dell'osso e del midollo osseo, nell'ingegneria tissutale e nella ricerca sul cancro. Questo modello si basa su un idrogel sintetico a base di PEG che viene funzionalizzato con peptidi RGD e siti di scissione MMP e viene fuso con un gradiente di densità profondo su lastre di imaging a 96 pozzetti con fondo di vetro30. Questa piattaforma plug-and-play ha dimostrato di consentire la creazione di reti cellulari 3D altamente interconnesse senza la necessità di incapsulare le cellule nell'idrogel. Simile al protocollo di incapsulamento cellulare descritto in precedenza, in questo lavoro, mostriamo il rimodellamento del substrato da parte di un ECM28 inerente alla cellula per creare un microambiente specifico del tipo di cellula. Pertanto, con questo metodo, i saggi di screening dei farmaci e le analisi ad alto contenuto possono essere facilmente eseguiti in condizioni di coltura 3D organotipiche altamente riproducibili. Le piastre da 96 pozzetti con fondo in vetro e gli idrogel otticamente trasparenti rendono la piattaforma compatibile con l'automazione della movimentazione dei liquidi e la microscopia ad alta produttività.

Il primo passo per generare una nicchia osteogenica del midollo osseo vascolare è la pre-coltura di hBM-MSCs sull'idrogel PEG per almeno 3 giorni. Durante questo periodo, si attaccano all'idrogel, lo penetrano e iniziano a stabilire contatti cellula-cellula e deposizione ECM. Prima di seminare le hBM-MSC, è necessario rimuovere il buffer di archiviazione. Poiché l'idrogel si trova all'interno di un pozzetto interno all'interno del pozzetto standard della piastra di imaging a 96 pozzetti, è sicuro inserire la punta di aspirazione lungo il lato del pozzetto fino a toccare l'anello del pozzo interno. Una pompa per vuoto può essere utilizzata per l'aspirazione se è impostata alla forza di aspirazione più bassa possibile. In alternativa, è possibile utilizzare una lavapiastre automatizzata con l'altezza dell'ugello regolata ad almeno 0,8 mm sopra l'anello del pozzo interno per aspirare il tampone dalla piastra di idrogel. L'utilizzo dell'automazione per la gestione dei liquidi può ridurre al minimo i danni alla superficie dell'idrogel e portare a una maggiore riproducibilità delle colture risultanti. Piccoli difetti sulla superficie dell'idrogel diventano visibili una volta che le cellule si depositano sull'idrogel e appaiono su un piano di messa a fuoco inferiore nelle aree di idrogel difettose. Pertanto, l'acquisizione di immagini di riferimento il giorno 0 funge da buon controllo di qualità per l'omogeneità della semina cellulare e l'integrità della superficie dell'idrogel. Mentre piccoli difetti superficiali dell'idrogel non precludono l'ulteriore utilizzo del pozzo, le cellule tendono a raggrupparsi sulle aree difettose e possono crescere in modelli non rappresentativi o raggiungere più rapidamente il vetro inferiore, dove crescono in un monostrato. Questi artefatti devono essere annotati quando si utilizzano / valutano questi pozzi. Considerazioni analoghe valgono per qualsiasi modifica del mezzo eseguita durante l'intera durata del test.

La seconda fase del protocollo prevede l'aggiunta di GFP-HUVEC alla monocoltura hBM-MSC preformata (giorno 0 della co-coltura). L'ECM depositato dall'hBM-MSC fornisce una grande impalcatura per la crescita delle cellule endoteliali, che in questo lavoro, anche in presenza di mezzo condizionato da hBM-MSC, potrebbero formare solo cluster di cellule rotonde sugli idrogel (non mostrato). Dopo la semina sulle colture hBM-MSC, gli HUVEC si integrano e formano strutture simili a microvasi paragonabili a quelle osservate nelle co-colture generate dall'incapsulamento cellulare27,28. Tipicamente, reti microvascolari 3D ben sviluppate si formano entro 4 giorni dalla co-coltura, e questo può essere monitorato longitudinalmente mediante l'uso di HUVEC marcati con GFP. Queste strutture possono essere mantenute per almeno 7 giorni in coltura, il che significa che c'è tempo sufficiente per seguire i cambiamenti nell'organizzazione della rete vascolare in risposta ai trattamenti, come per lo screening dei farmaci anti-angiogenici. Gli elementi morfologici della rete endoteliale possono essere quantificati in modalità batch segmentando le immagini GFP utilizzando strumenti consolidati, come il plugin Angiogenesis Analyzer di ImageJ33, e i loro parametri possono essere utilizzati per valutare, ad esempio, l'efficacia del farmaco e la farmacodinamica.

Un vantaggio significativo del modello cellulare descritto per molte potenziali applicazioni è la sua plasticità. La semplice integrazione del terreno di coltura con diversi fattori di crescita può cambiare l'aspetto della co-cultura. Ad esempio, la presenza di BMP-2 durante tutto il periodo di mono e co-coltura crea una nicchia vascolare osteogenica, mostrando un aumento dell'attività ALP, la deposizione extracellulare di calcio, nonché l'assemblaggio e la deposizione di ECM. Al contrario, in presenza di FGF-2, i marcatori osteogenici sono assenti e la co-coltura forma meno associazioni cellulari laterali ma mostra una crescita cellulare 3D più pronunciata. Il fatto che FGF-2 sopprima l'attività di ALP mentre BMP-2 susciti un'attività ALP più forte rispetto a nessun trattamento con fattori di crescita è in accordo con le osservazioni precedenti27. Tuttavia, nonostante queste grandi differenze nella componente stromale hBM-MSC, l'estensione della rete microvascolare era molto simile per le due condizioni trattate con fattore di crescita in questo lavoro. Nelle colture di controllo, si sono formate solo poche reti vascolari corte, che rappresentano forse una nicchia del midollo osseo scarsamente vascolarizzata. Ciò suggerisce che semplicemente cambiando il tipo, la concentrazione e la tempistica dei fattori di crescita aggiunti al terreno di coltura, potrebbe essere prodotta una gamma di nicchie vascolarizzate, come sarebbe richiesto per gli studi comparativi. Tuttavia, per garantire risultati riproducibili, è importante notare che la progressione e la morfologia della coltura possono variare a seconda della storia delle cellule utilizzate (ad esempio, il numero di passaggio e il metodo di distacco utilizzato durante il mantenimento ordinario della coltura), ed è consigliabile controllare tali fattori durante la progettazione del test.

Qui, come prima applicazione di questo modello, dimostriamo la sensibilità delle reti microvascolari ingegnerizzate al trattamento con bevacizumab da 10 μg/ml. In particolare, è importante confermare che l'algoritmo utilizzato è in grado di riconoscere con precisione la rete endoteliale, poiché gli artefatti vengono spesso generati in immagini con reti poco sviluppate. In questo caso, i parametri utilizzati per l'elaborazione delle immagini (prima e durante la segmentazione) devono essere ottimizzati, spesso sulla base di tentativi ed errori.

Come seconda applicazione, presentiamo un modello avanzato di co-coltura formato dalla semina sequenziale di cellule mesenchimali, endoteliali e tumorali. Questo modello consente di studiare le interazioni tra le cellule tumorali, lo stroma e la vascolarizzazione del midollo osseo, che possono essere fattori importanti durante le metastasi. Inoltre, questo modello potrebbe essere utilizzato per applicazioni di screening farmacologico e test di composti con obiettivi oltre l'angiogenesi.

Nelle colture 2D, le cellule non ricevono segnali microambientali fisiologici, non acquisiscono morfologie cellulari naturali e, di conseguenza, si differenziano in modo diverso rispetto alle cellule negli ambienti 3D nativi35. Quando coltivate in idrogel 3D ingegnerizzati, le cellule depositano precocemente una ECM intrinseca, che fornisce siti di adesione e può essere attivamente rimodellata 28,36. Qui, per stabilire un modello 3D semplificato per le applicazioni di screening, le cellule che formano i vasi sono state seminate sulla superficie di idrogel ingegnerizzati e hanno permesso di stabilire reti vascolari in assenza di perfusione. Le valutazioni basate sull'imaging sono state condotte su proiezioni 2D delle cellule endoteliali che contribuiscono alle strutture vascolari. Tuttavia, solo le immagini confocali hanno rivelato la crescita meno pronunciata delle reti vascolari 3D nei campioni stimolati da BMP-2 rispetto ai campioni stimolati da FGF-2. Ciò suggerisce che la lunghezza delle strutture vascolari formate è stata sottostimata, mentre la loro connettività è stata sovrastimata. Inoltre, non sono state studiate le interazioni tra cellule perivascolari ed endoteliali e la formazione del lume vascolare. Questi aspetti, soprattutto in termini di risposte al trattamento farmacologico, richiederanno ulteriore attenzione. Infine, protocolli raffinati per stabilire prima estese reti vascolari 3D e solo successivamente indurre la loro differenziazione osteogenica sarebbero auspicabili per generare modelli più fisiologici di ossa e midollo osseo.

Nel complesso, il modello qui presentato è altamente versatile e può essere facilmente adattato per applicazioni specifiche. Ad esempio, potrebbero essere utilizzate cellule mesenchimali ed endoteliali provenienti da fonti diverse. È noto che le MSC del tessuto adiposo e le MSC del cordone ombelicale esprimono fattori angiogenici diversi rispetto alle BM-MSC e possono essere facilmente sostituite come componente stromale alternativa37. Le cellule endoteliali isolate da nicchie di midollo osseo già definite potrebbero anche essere utilizzate al posto degli HUVEC. Si potrebbe anche stabilire la co-coltura con cellule mesenchimali ed endoteliali del midollo osseo derivate dal paziente e corrispondenti per applicazioni di medicina personalizzata, come è stato recentemente suggerito per le co-colture muscolari vascolarizzate38. Inoltre, il design della piastra di idrogel consente il monitoraggio longitudinale della coltura sia con microscopia a campo chiaro che a fluorescenza, offrendo così all'utente la possibilità di abbreviare o estendere il tempo di coltura a seconda dell'applicazione. In alternativa, le densità cellulari utilizzate per la semina potrebbero essere regolate di conseguenza per accelerare o ritardare la formazione della rete cellulare se sono necessari tempi di osservazione più brevi o più lunghi di quelli di questo protocollo. In ogni caso, è necessaria cautela per evitare la crescita eccessiva delle cellule in strutture simili a fogli, che possono portare alla contrazione dell'idrogel e all'eventuale distacco cellulare.

Infine, è possibile eseguire un'ampia gamma di saggi utilizzando questo modello. Oltre all'immunofluorescenza e alla microscopia eseguite in colture vive o fisse, le colture 3D possono essere digerite enzimaticamente e le cellule possono essere recuperate e sottoposte a qualsiasi tipo di saggio biochimico. Qui, dimostriamo la determinazione dell'attività ALP e la quantificazione del contenuto di DNA nei lisati cellulari utilizzando saggi colorimetrici / fluorometrici, ma il sistema è compatibile con molte altre tecniche, tra cui PCR, RNAseq e proteomica. Se la sensibilità del saggio desiderato non è molto elevata, è possibile raggruppare campioni da più di un pozzo per aumentare la quantità di campione disponibile per il test. Se l'applicazione desiderata richiede una dissoluzione del gel più rapida, lo scuotimento orbitale della piastra potrebbe essere applicato in combinazione con volumi più piccoli della soluzione digestiva per garantire la formazione di vortici nei pozzetti, supponendo che tutti i pozzetti sulla piastra saranno utilizzati in questo modo (le colture viventi sono sensibili a una manipolazione così dura). In sintesi, presentiamo qui un protocollo che, se utilizzato come descritto, garantisce la generazione di un modello in vitro che ricapitola gli aspetti chiave delle nicchie vascolari osteogeniche ma è anche abbastanza versatile da essere modificato per applicazioni su misura.

Divulgazioni

Ectica Technologies AG è il produttore della piastra per pozzi in idrogel 3DProSeed e ha interessi commerciali. Benjamin R. Simona e Martin Ehrbar sono azionisti di Ectica Technologies AG.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Riccardo Urbanet per l'assistenza tecnica con i dispositivi di gestione dei liquidi e Rodi Odabasi per il supporto con la microscopia a epifluorescenza. Questo lavoro è stato finanziato dal Fondo nazionale svizzero (numero di sovvenzione 310030E_202429 e 205321_204318) e da Ectica Technologies AG.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-072
2 mL microtubesEppendorf30120094
2-Amino-2-methyl-1-propanolSigmaA9199
3DProSeed hydrogel well plateEctica TechnologiesECT.PS1.001.096
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrateSigma71768
Alizarin Red SSigmaA5533
Anti-Collagen IV antibodyAbcamab6311
Anti-Laminin 1+2 antibodyAbcamab7463
Automated plate washerAgilent BiotekELχ50
Automated washer/dispenserAgilent BiotekMULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette
BevacizumabEvidenticID PS-E07-2019-00119 A009
BMP-2Peprotech120-02C
BSAAppliChemA1391
CentrifugeEppendorf5415 RTo centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis
Confocal laser scanning microscopeLeicaStellaris 5
Conical 50 mL centrifuge tubesTPP91050
DAPISigmaD9542
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) AntibodyBiolegend406406
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) AntibodyBiolegend405312
EGM-2LonzaCC-3162
Epifluorescence microscopeLeicaDMI6000B
FBSGibco10500-064
FGF-2Peprotech100-18B
Fibronectin (IST-9)Santa Cruzsc-59826
GFP-HUVECsPELOBiotechPB-CAP-0001GFP
hBM-MSCs--Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359
Inverted microscopeZeiss200M
Magnesium chlorideSigmaM8266
MDA-MB-231 breast cancer cell line-Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
MEMαGibco22571-038
Multimode imaging readerAgilent BiotekCytation 1For automated imaging
Multimode imaging reader - fluorescence and absorbanceAgilent BiotekCytation 5For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis
ParaformaldehydeArtechemisUS 040
PBSGibco10010-015
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Phalloidin-rhodamineInvitrogenR415
Picro-Sirius Red SolutionAbcamab246832
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kitThermoFisher ScientificP7589
Recombinant Anti-Collagen I antibodyAbcamab260043
SIGMAFAST BCIP/NBTSigmaB5655-25TAB
Sodium hydroxideSigma1064981000
Sodium phosphate dibasic, anhydrousSigmaS-0876
Sodium phosphate monobasic, monohydrateMerck1.06346
Triton X-100SigmaT8787
Tween20AppliChemA4974
U2OS osteosarcoma cell line-Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich 
α-trehalose dihydrateSigma90208

Riferimenti

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