Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt whole mount Immunhistochemie, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster eines Antigens visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von Jane Dodd und Tom Jessell eingeführt.

Zusammenfassung

Der Hühnerembryo ist ein wertvolles Werkzeug in der Studie der frühen Embryonalentwicklung. Seine Transparenz, Zugänglichkeit und einfache Handhabung machen ihn zu einem idealen Werkzeug zur Untersuchung der Antikörper-Expression im sich entwickelnden Gehirn, Neuralrohr und Somiten. Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte ganz-mount Antikörper-Färbung mit HRP konjugierte Sekundärantikörper; Erste, der Embryo aus dem Ei präpariert und fixiert in Paraformaldehyd. Zweitens endogene Peroxidase inaktiviert wird; Der Embryo wird dann in primärer Antikörper ausgesetzt. Nach mehrmaligem Waschen wird der Embryo mit sekundärem Antikörper, konjugiert mit HRP inkubiert. Peroxidase-Aktivität zeigte mit Reaktion mit Diaminobenzidin Substrat. Schließlich ist der Embryo fixiert und für die Fotografie und Schneiden. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern ist, dass Embryonen für Wachs Schnitte verarbeitet werden, so dass die Untersuchung von Antigen-Sites im Querschnitt. Diese Methode wurde ursprünglich von Jane Dodd und Tom Jessell eingeführt

Protokoll

I. Schematische Übersicht:

Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte in whole mount Immunhistochemie in Hühnerembryo. Zunächst wird der Embryo in PFA fixiert [IHC1]. Dann wird die endogene Peroxidase Aktivität abgeschreckt [IHC2]. Der Embryo wird dann in Primärantikörper [IHC3] inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wird der Embryo in sekundärem Antikörper [IHC4]; Farbreaktion zeigte mit DAB [IHC5] und Antikörper-Färbung erscheint orange [IHC6].

Teil 1: Befestigung des Embryos

1. Um ganze Berg Immunhistochemie auf Hühnerembryonen, öffnen Sie zunächst ein Ei, indem Sie die Schale mit einer Pinzette und Entfernen von Teilen der Schale.
2. Entfernen Sie die dicken Albumin mit einer Pinzette, und kippen Sie den Dottersack mit groben Pinzette so, dass der Embryo nach oben zeigt.
3. Mit einer feinen Schere, schneiden Sie ein Quadrat der Dottersack rund um den Embryo. Entfernen Sie den Embryo aus dem Eigelb mit einem Löffel, und in eine Schale mit PBS.
4. Unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Sie vorsichtig die Membranen und Eigelb und dem Embryotransfer eine frische Schale mit PBS.
5. Pin der Embryo sich mit einer Pinzette und Insekten Pins, und saugen Sie den PBS. Ersetzen Sie diese mit 4% PFA in PBS und lassen den Embryo bis 1h bei RT fixieren.

Teil 2: Vorbereiten Embryonen für die Antikörper-Schritt

1. Zur Minimierung der potenziellen mikrobiellen Kontamination, verwenden ddH ₂ O in allen folgenden Schritten.
2. Nach der Embryo fixiert ist, saugen die Fixierlösung und ordnungsgemäß entsorgen als chemischer Abfall. Füllen Sie die Schale mit PBS.
3. nächsten, mit einer Mikrodissektion Messer, schneiden Sie ein Quadrat um Embryo extraembryonalen Membranen zu entfernen. Entfernen Insektennadeln mit einer Pinzette.
4. Nach der Stifte entfernt wurden, mit einer stumpfen Ende Pasteurpipette auf den Embryo zu einem Szintillations Fläschchen mit PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X) zu übertragen.
5. Waschen Sie den Embryo mit PBT, 3-mal für jeweils 10 Minuten.
6. Entfernen PBT von der Scintillationsfläschchen, und ersetzen Sie mit PBTx mit 0,3% H ₂ O _2, um mögliche endogene Peroxidase zu inaktivieren.
7. Inkubieren für 2 h bei RT auf Kolbenpendel.
8. Wash Embryo mit PBT, 3-mal für jeweils 10 Minuten, dann 3 mal für jeweils 30 Minuten.

Teil 3: Antikörper Inkubation

1. Um Flecken auf den Embryo mit dem Antikörper durch Waschen der Embryo für eine Stunde in Blocking-Puffer oder 1% BSA / 1% NGS / PBT (wir verwenden NGS, weil der sekundäre Antikörper in Ziege angehoben wird) zu starten. Inkubieren auf Kolbenpendel für eine Stunde bei RT.
2. Verdünnen Sie den Primärantikörper 1:1 in Blocking-Puffer, und inkubieren Embryo in dieser Lösung für 2 Tage bei 4 ° C auf Kolbenpendel. Primärer Antikörper Verdünnungsfaktor hängt von der Wahl des primären Antikörpers. Hier verwenden wir ein Antikörper aus dem Developmental Studies Hybridoma Bank, die als Überstand vorgesehen ist. Wir verdünnen 1:1 in Blocking-Puffer.
3. Führen Sie danach 3 10-minütige Waschungen in PBT, um 3 1-Stunden-Wäschen in PBT gefolgt.
4. Nach dem Waschen, verdünnte den sekundären Antikörper 1:2500 in Blocking-Puffer (in diesem Fall Peroxidase konjugierten Ziege anti-Maus IgG (H + L), und inkubieren Embryo in dieser Lösung O / N bei 4 ° C auf Kolbenpendel.
5. Führen Sie 3 10-minütige Waschungen in PBT, um 3 1-Stunden-Wäschen in PBT gefolgt.

Teil 3: Farbreaktion

1. Zur Entwicklung der Farbreaktion der gefärbten Embryo, führen Sie zuerst 2 20-minütige Waschungen in Tris-Puffer (100 mM Tris HCl, pH 7,4).
2. Inzwischen lösen sich DAB Substrat (3,3 '-Diaminobenzidintetrahydrochlorid) in Tris-Puffer bei 500μg/ml unter Abzug; halten Lösung in dunklen, auf Eis.
3. Entfernen letzten Tris-Puffer waschen aus dem Fläschchen mit Embryo und ersetzen mit 5 ml DAB-Lösung aus Schritt 3.2. Keep in Dunkelheit auf Kolbenpendel für 20 mn. Entsorgen Eppendorfspitze in Eimer mit einer 10% igen Bleichlösung um DAB zu dekontaminieren.
4. In der Zwischenzeit bereiten 0,3% Lager H ₂ O ₂ in dH ₂ O auf dem Eis.
5. Add 50 ul Lager H ₂ O ₂ zu Fläschchen mit Embryonen in DAB. Keep in dunkel. Nach 1-2 Minuten, zu überwachen Reaktion unter dem Mikroskop.

Teil 4: Embryo-Verarbeitung für Fotografie und Histologie

1. Wenn Farbreaktion abgeschlossen ist, von DAB verfügen in bleach Eimer. Ersetzen Sie mit 5 ml Leitungswasser.
2. Führen Sie 2 10-minütige Waschungen in PBS.
3. Für die Verarbeitung für die Fotografie und Wachs Schnitte, in einer Ethanol-Reihe dehydrieren (25%, 50%, 75% und 100%) für jeweils 10 Minuten.
4. Ersetzen Sie das Ethanol mit 0,5 bis 1 ml Zedernholz Öl (dieser wird der Embryo durchscheinend zu machen). Prozess für die Fotografie in Zedernholz Öl.
5. Nach Fotografie, Rückkehr Embryo Fläschchen und ersetzen Sie das Zedernholz Öl mit 100% Ethanol. Wiederholen Sie Schritt Ethanol.
6. Ersetzen Sie ethanol mit 5% Fast Green FCF in 100% Ethanol und Inkubation für 3 Minuten (dieser Schritt wird sichtbar Embryonen für die Histologie). Ersetzen Fast Green FCF-Lösung mit 100% Ethanol und Verfahren für die Histologie.

Repräsentative Ergebnisse:

In den Beispielen unten gezeigt, sind Embryonen in den Stadien HH 10 (A), 12 (B) und 11 (C) seziert; Embryonen zeigen Ausdruck PAX 7 in Schwellenländern neuronalen Crestas sowie in Somiten und Neuralrohr (A, B); In (C), ist Chorda mit 15.3B9 (Not-1) (Antibodies by Developmental Studies Hybridoma Bank hat) gekennzeichnet.

Diskussion

Dieses Video zeigt die verschiedenen Schritte bei der Durchführung ganz-mount Antikörper-Färbung bei jungen Hühnerembryonen. Dieses Protokoll ist im Wesentlichen für die räumliche und zeitliche Charakterisierung neuartiger Antikörper in chick ^2,3 verwendet, sowie für die Verwendung bekannter antigener Marker zu embryonalen Missbildungen folgenden Beleidigung ^{4 zu} bestimmen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eggs		Charles River Laboratories	Premium Fertile	Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator	Other	Lyon	RX
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Tool	Fine Science Tools	11002-13
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Microdissecting knife	Tool	Fine Science Tools	10056-12	Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
30% H2O2	Reagent	Sigma-Aldrich	H1009
BSA	Reagent	Sigma-Aldrich	A3803
NGS	Reagent	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Primary Antibodies	Reagent	Developmental Studies Hybridoma Bank	4G11, 15.3B9, PAX7	For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Reagent	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	34001	Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.
Cedar wood oil	Reagent	Sigma-Aldrich	W522503
Fast green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F7252
Minuten pins 0.2mm diam		Fine Science Tools	26002-20