Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

Riepilogo

Questo video dimostra tutta montare immunoistochimica, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale di un antigene può essere visualizzata in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell.

Abstract

L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare l'espressione di anticorpi nello sviluppo del cervello, del tubo neurale e somite. Questo video mostra le diverse fasi, in tutto il montaggio colorazione anticorpale utilizzando anticorpi coniugati con HRP secondaria; In primo luogo, l'embrione è sezionato dall'uovo e fissati in paraformaldeide. In secondo luogo, perossidasi endogena è inattivato; L'embrione viene quindi esposto a anticorpo primario. Dopo numerosi lavaggi, l'embrione viene incubato con l'anticorpo secondario coniugato con HRP. Perossidasi viene rivelato tramite la reazione con il substrato diaminobenzidina. Infine, l'embrione è fisso ed elaborati per la fotografia e sezionamento. Il vantaggio di questo metodo rispetto all'uso di anticorpi fluorescenti è che gli embrioni possono essere trattati per sezionamento cera, permettendo così lo studio dei siti antigene nella sezione trasversale. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell

Protocollo

I. Panoramica schematica:

Questo video mostra le diverse fasi in immunoistochimica montare tutto in embrione di pollo. In primo luogo, l'embrione è fissato in PFA [IHC1]. Poi, l'attività della perossidasi endogena si spegne [IHC2]. L'embrione viene quindi incubato in anticorpo primario [IHC3]. Dopo numerosi lavaggi, l'embrione viene incubato in anticorpo secondario [IHC4]; reazione del colore è rivelato utilizzando DAB [IHC5] e colorazione anticorpale sembra arancione [IHC6].

Parte 1: fissaggio degli embrioni

1. Per eseguire immunoistochimica intero montare su embrioni di pollo, per prima cosa aprire un uovo toccando il guscio con una pinza e rimuovere i pezzi del guscio.
2. Rimuovere l'albumina spessore con una pinza, e inclinare il sacco vitellino con una pinza grossolana in modo che l'embrione verso l'alto.
3. Utilizzando forbici, tagliare un quadrato di tutto il sacco vitellino dell'embrione. Rimuovere l'embrione dal tuorlo con un cucchiaio, e mettere in un piatto contenente PBS.
4. Sotto un microscopio dissezione, rimuovere con attenzione le membrane e il tuorlo e il trasferimento degli embrioni per un piatto fresco contenente PBS.
5. Perno l'embrione giù con una pinza e perni di insetti, e aspirare il PBS. Sostituirlo con PFA 4% in PBS, e consentire l'embrione di fissare 1 ora a temperatura ambiente.

Parte 2: Preparazione di embrioni per la fase di anticorpi

1. Per ridurre al minimo potenziale contaminazione microbica, utilizzare DDH ₂ O in tutti i passaggi successivi.
2. Dopo che l'embrione è fisso, aspirare la soluzione di fissativo e smaltire come rifiuto chimico. Riempire il piatto con PBS.
3. prossimo, con un coltello microdissezione, tagliare un quadrato attorno embrione per rimuovere membrane extraembrionali. Rimuovere le spine di insetti con una pinza.
4. Dopo i perni sono stati rimossi, utilizzare una pipetta Pasteur smussato fine di trasferire l'embrione in una fiala contenente scintillazione con PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X).
5. Lavare l'embrione con PBT, 3 volte per 10 minuti ciascuno.
6. Rimuovere PBT dal flaconcino scintillazione, e sostituirlo con PBTx contenenti 0,3% di H ₂ O ₂ al fine di inattivare perossidasi potenziale endogeno.
7. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente su nutator.
8. Lavare embrione con PBT, 3 volte per 10 minuti ciascuno, poi 3 volte per 30 minuti ciascuno.

Parte 3: incubazione anticorpi

1. Per colorare l'embrione con l'anticorpo, inizia lavando l'embrione per un'ora in tampone di bloccaggio o 1% BSA / 1% NGS / PBT (usiamo NGS perché l'anticorpo secondario è sollevata in capra). Incubare su nutator per un'ora a temperatura ambiente.
2. Diluire l'anticorpo primario 1:1 in tampone di bloccaggio, e incubare embrione in questa soluzione per 2 giorni a 4 ° C il nutator. Primario fattore di diluizione degli anticorpi dipende dalla scelta di anticorpo primario. Qui, usiamo un anticorpo dal Developmental Studies Ibridoma Banca, che viene fornito come supernatent. Noi diluirlo 1:1 in tampone di bloccaggio.
3. successiva, eseguire 3 10 minuti lava in PBT, seguita da 3 1-ora lavaggi in PBT.
4. Dopo il lavaggio, diluire l'anticorpo secondario 1:2500 in tampone di bloccaggio (in questo caso coniugato perossidasi-capra anti-topo IgG (H + L), embrione e incubare in questa soluzione O / N a 4 ° C su nutator.
5. Eseguire 3 10 minuti di lavaggi in PBT, seguita da 3 1-ora lavaggi in PBT.

Parte 3: reazione del colore

1. Per sviluppare la reazione colore dell'embrione macchiato, prima eseguire 2 20 minuti di lavaggi in tampone Tris (100mM Tris HCl, pH 7,4).
2. Nel frattempo sciogliere substrato DAB (3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro) nel tampone Tris a 500μg/ml sotto cappa aspirante; tenere soluzione nel buio, sul ghiaccio.
3. Rimuovere ultimi tampone di lavaggio Tris dall'embrione fiala contenente e sostituirlo con la soluzione DAB 5ml dal punto 3.2. Tenere in scuro su nutator per 20 mn. Smaltire Eppendorf punta nel secchio contenente una soluzione di candeggina al 10% per decontaminare DAB.
4. Nel frattempo preparare uno stock 0,3% H ₂ O ₂ in dh ₂ O sul ghiaccio.
5. Aggiungere il brodo di 50μl H ₂ O ₂ al flacone contenente gli embrioni in DAB. Tenere al buio. Dopo 1-2 minuti, monitorare la reazione al microscopio.

Parte 4: embrioni per la fotografia e istologia

1. Quando la reazione del colore è completa, smaltire DAB in secchio di candeggina. Sostituire con 5 ml di acqua del rubinetto.
2. Eseguire 2 10 minuti di lavaggi in PBS.
3. Al processo per la fotografia e sezionamento cera, disidratano in una serie di etanolo (25%, 50%, 75% e 100%) per 10 minuti ciascuno.
4. Sostituire l'etanolo da 0,5 - 1 ml di olio di cedro legno (questo renderà il traslucido embrione). Processo per la fotografia in olio di legno di cedro.
5. A seguito di fotografia, di ritorno embrione a fiala e sostituire l'olio di legno di cedro con il 100% di etanolo. Ripetere il punto etanolo.
6. Sostituire ethanol con il 5% FCF veloce verde in 100% etanolo, e incubare per 3 minuti (questo passo renderà visibili gli embrioni per istologia). Sostituire rapida soluzione verde FCF con il 100% di etanolo e di processo per l'esame istologico.

Rappresentante dei risultati:

Negli esempi mostrati di seguito, gli embrioni vengono sezionati in fasi HH 10 (A), 12 (B) e 11 (C); Embrioni mostrano espressione di PAX 7 in emergenti Crestas neurali così come in somiti e del tubo neurale (A, B); In (C), notocorda è etichettato con 15.3B9 (Non-1) (Anticorpi fornite dal Developmental Studies Ibridoma Bank).

Discussione

Questo video mostra le varie fasi di esecuzione di tutto il montaggio colorazione anticorpi in embrioni di pollo giovani. Questo protocollo è essenzialmente utilizzato per la caratterizzazione spaziale e temporale di anticorpi romanzo in pulcino ^2,3, così come per l'uso di marcatori antigenica nota per determinare malformazioni embrionali seguenti insulto ^4.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eggs		Charles River Laboratories	Premium Fertile	Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator	Other	Lyon	RX
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Tool	Fine Science Tools	11002-13
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Microdissecting knife	Tool	Fine Science Tools	10056-12	Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
30% H2O2	Reagent	Sigma-Aldrich	H1009
BSA	Reagent	Sigma-Aldrich	A3803
NGS	Reagent	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Primary Antibodies	Reagent	Developmental Studies Hybridoma Bank	4G11, 15.3B9, PAX7	For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Reagent	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	34001	Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.
Cedar wood oil	Reagent	Sigma-Aldrich	W522503
Fast green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F7252
Minuten pins 0.2mm diam		Fine Science Tools	26002-20