Метод полного окрашивания антител горе в Чик

Резюме

Это видео демонстрирует весь горе иммуногистохимии, метод, которым пространственной и временной экспрессии антигена могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell.

Аннотация

Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для исследования антител выражение в развитии мозга, нервной трубки и сомитов. Это видео демонстрирует различные этапы в целом монтажа антител окрашивания использования HRP сопряженных вторичными антителами; Во-первых, эмбрион расчлененное из яйца и зафиксирована в параформальдегида. Во-вторых, эндогенной пероксидазы инактивированная; эмбрион затем подвергаются первичного антитела. После нескольких промывок, эмбрион инкубировали с вторичными антителами конъюгированных с ПХ. Пероксидазы активность обнаруживаются с помощью реакции с диаминобензидина подложки. Наконец, зародыш фиксируется и обрабатывается для фотографирования и секционирования. Преимущество этого метода по сравнению с использованием флуоресцентных антител является то, что эмбрионы могут быть обработаны для воска секционирования, что позволяет изучать антигена сайтов в поперечном сечении. Этот метод впервые был введен Джейн Додд и Том Jessell

протокол

I. Схема Обзор:

Это видео демонстрирует различные этапы в целом иммуногистохимии монтирования в куриных эмбрионах. Во-первых, эмбрион закрепляется в PFA [IHC1]. Затем, эндогенной активности пероксидазы гасится [IHC2]. Эмбрион затем инкубировали в первичных антител [IHC3]. После нескольких промывок, эмбрион инкубировали в вторичными антителами [IHC4]; Цветная реакция проявляется использования DAB [IHC5] и антитела окрашивания цвет на оранжевый [IHC6].

Часть 1: Крепление эмбрионов

1. Для выполнения целого иммуногистохимии крепление на куриных эмбрионах, сначала откройте яйца, нажав оболочки с пинцетом и удаление части корпуса.
2. Удалить толстые альбумина с щипцами, и наклон желточного мешка с грубыми щипцами, чтобы эмбрион лица вверх.
3. Использование тонких ножниц, вырезать квадратный желточного мешка вокруг эмбриона. Удалить из эмбриона желток с ложкой, и место в блюдо с PBS.
4. Под микроскопом рассечение, осторожно удалите мембраны и желток и перенос эмбрионов в свежем блюдо с PBS.
5. Pin эмбриона вниз щипцами и насекомых булавками, и аспирата PBS. Замените это с 4% PFA в ФБР, и позволить эмбриону исправить 1 час при комнатной температуре.

Часть 2: Подготовка эмбрионы на наличие антител шаг

1. Чтобы свести к минимуму возможное загрязнение микробов, использования DDH ₂ O во всех следующих шагов.
2. После эмбриона фиксировано, аспирация фиксирующий раствор и распоряжаться надлежащим образом как химические отходы. Заполните блюдо с PBS.
3. Далее, используя микродиссекции ножом, вырезать квадрат вокруг эмбриона, чтобы удалить экстраэмбриональных мембран. Удалить насекомых булавками с щипцами.
4. После контакты были удалены, используйте тупым концом пипетки Пастера перенести эмбрион сцинтилляционный флакон с PBT (PBS рН 7,4, 0,5% Triton X).
5. Вымойте эмбриона с PBT, 3 раза в течение 10 минут каждый.
6. Удалить из PBT сцинтилляционный флакон, и заменить PBTx, содержащие 0,3% H ₂ O _2, чтобы инактивировать потенциал эндогенной пероксидазы.
7. Инкубируйте в течение 2 часов при комнатной температуре на nutator.
8. Вымойте эмбриона с PBT, 3 раза по 10 минут каждый, а затем 3 раза по 30 минут каждый.

Часть 3: Антитела инкубации

1. Для окраски эмбриона с антителами, начните с стиральной эмбрионов в течение одного часа в блокирующем буфере или 1% BSA / 1% NGS / PBT (мы используем NGS потому вторичными антителами возникает в козла). Инкубировать на nutator в течение одного часа при комнатной температуре.
2. Развести первичного антитела 1:1 в блокирующий буфер, и инкубировать эмбриона в этом растворе в течение 2 дней при температуре 4 ° С на nutator. Первичный фактор разведения антител зависит от выбора первичного антитела. Здесь мы используем антитела из Развития Исследований Гибридома банка, который предоставляется в качестве supernatent. Мы разбавить его 1:1 в блокирующем буфере.
3. Следующая, выполнять три 10-минутные моется в PBT, а затем 3 1-час моется в PBT.
4. После мытья, разбавленных вторичных антител 1:2500 в блокирующем буфере (в данном случае пероксидазы сопряженным-антимышиного IgG (H + L) и инкубировать эмбриона в этом растворе O / N при температуре 4 ° С на nutator.
5. Выполните три 10-минутные моется в PBT, а затем 3 1-час моется в PBT.

Часть 3: Цветная реакция

1. Разработать цвет реакция окрашенных эмбриона, сначала выполнить две 20-минутные моется в трис-буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4).
2. Тем временем растворяются DAB субстрата (3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride) в трис-буфере на 500μg/ml под вытяжным шкафом; держать раствор в темноте, на льду.
3. Удаление последнего буфера Трис вымыть из флакона эмбриона и заменить 5 мл раствор DAB с шагом 3.2. Хранить в темном на nutator на 20 млн. Утилизировать Эппендорф чаевые в емкость, содержащую 10% гипохлоритом натрия для того, чтобы обеззараживать DAB.
4. Тем временем подготовить 0,3% акций H ₂ O ₂ в дН ₂ O на льду.
5. Добавить 50 мкл акции H ₂ O ₂ на флакон, содержащий эмбрионов в DAB. Имейте в темноте. Через 1-2 минут, контролировать реакции под микроскопом.

Часть 4: Эмбрион обработки фотографий и гистологии

1. Когда цветная реакция завершена, распоряжаться DAB в отбеливатель ведро. Заменить на 5 мл водопроводной воды.
2. Выполните 2 10-минуте моется в PBS.
3. Для обработки для фотографии и воска секционирования, обезвоживаются в серии этанола (25%, 50%, 75% и 100%) в течение 10 минут каждый.
4. Замените этанола с 0,5 - 1 мл масла кедрового дерева (это сделает эмбриона полупрозрачные). Процесс фотографии в масле кедрового дерева.
5. После фотографии, вернуть эмбрион флакон и заменить масло кедрового дерева со 100% этанола. Повторите этанола шаг.
6. Замените электроннойthanol с 5% Быстрый зеленый FCF в 100% этанола, и инкубировать в течение 3 минут (этот шаг сделает эмбрионов видимым для гистологии). Замените Быстрый зеленый раствор FCF со 100% этанола и процесс гистологии.

Представитель Результаты:

В примерах, приведенных ниже, эмбрионы расчлененный на этапах HH 10 (А), 12 (Б) и 11 (С); Эмбрионы показать выражение PAX 7 на развивающихся нейронных crestas также в сомитов и нервной трубки (А, В); В (С), хорда помечена 15.3B9 (Не-1) (Антитела предоставляемые развитием исследований Гибридома банк).

Обсуждение

Это видео демонстрирует различные этапы в выполнении целого монтажа антител окрашивания у молодых куриных эмбрионов. Этот протокол существенно используется пространственная и временная характеристика новых антител в куриных ^2,3, а также для использования известных маркеров дл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eggs		Charles River Laboratories	Premium Fertile	Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator	Other	Lyon	RX
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Forceps (2)	Tool	Fine Science Tools	11002-13
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Plastic dishes	Tool	Falcon BD	353001
Rubber Bulb	Tool	Electron Microscopy Sciences	70980
Pasteur Capillary Pipette	Tool	Electron Microscopy Sciences	70950-12	round edge under flame
Microdissecting knife	Tool	Fine Science Tools	10056-12	Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
30% H2O2	Reagent	Sigma-Aldrich	H1009
BSA	Reagent	Sigma-Aldrich	A3803
NGS	Reagent	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Primary Antibodies	Reagent	Developmental Studies Hybridoma Bank	4G11, 15.3B9, PAX7	For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Reagent	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	34001	Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.
Cedar wood oil	Reagent	Sigma-Aldrich	W522503
Fast green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F7252
Minuten pins 0.2mm diam		Fine Science Tools	26002-20